周淑芬 劉寶 張迪

摘 要：RRTZF基因在植物的生長發(fā)育和逆境脅迫中起著重要作用。OsTZF9基因是水稻RRTZF基因家族的一員，為分析OsTZF9基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建了由Ubiqutin啟動子驅(qū)動的植物過表達載體pCXUN-TZF9，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株6個克隆。進一步分析轉(zhuǎn)基因植株后代的表型發(fā)現(xiàn)，與野生型日本晴相比，OsTZF9基因過表達植株的株高、分糵數(shù)、有效穗數(shù)、穗長和千粒重均下降;與轉(zhuǎn)基因陰性分離株相比，OsTZF9基因過表達植株抽穗期推遲。

關(guān)鍵詞：水稻;OsTZF9基因;過量表達;表型分析

中圖分類號：S 511?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）11-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.001

Overexpression of OsTZF9 Gene Regulates Various Phenotypesof Growth and Development in Rice

ZHOU Shu-fen1，2， LIU Bao1，2， ZHANG Di1，2

（1. Institute of Biological Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China;

2. Fujian Key Laboratory of Agricultural Genetic Engineering， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： RR-TZF gene plays an important role in plant growth， development and stress responses. OsTZF9 gene is a member of rice RR-TZF gene family. In order to analyze the biological function of OsTZF9 gene， a plant overexpression vector pCXUN-TZF9 driven by Ubiqutin promoter was constructed， and 6 clones of transgenic regenerated plants were obtained by using the agrobacterium-mediated method. Further analysis of the phenotype of the progenies of the transgenic plants showed that plant height， tiller number， effective panicle number， panicle length and 1000-grain weight of the OsTZF9-overexpressed plants were decreased compared with those of the wild-type Nipponbare; compared with the transgenic negative isolated plants， heading date of the OsTZF9-overexpressed plants was delayed.

Key words：Rice; OsTZF9 gene; Overexpression; Phenotypic analysis

RRTZF基因是一類植物特有的CCCH型鋅指基因，因其編碼蛋白含有1個TZF模體及其上游50個氨基酸為富含精氨酸區(qū)（RR）而得名。不同于保守的TZF模體（CX8CX5CX3HX18CX8CX5CX3H），RRTZF蛋白中的TZF模體是由中間間隔16個氨基酸的兩個不同CCCH結(jié)構(gòu)域組成[1-2]。通過全基因組學(xué)分析，目前已在多種植物中鑒定了許多RRTZF成員，如在擬南芥、水稻、玉米、高粱、大豆、苜蓿和楊樹中分別鑒定了11、9、12、6、22、5和16個RRTZF基因，它們受多種發(fā)育階段和環(huán)境信號的影響，在植物中的表達模式呈多樣化[3]。

除了擬南芥中所有RRTZF基因的功能得到一定程度的解析，其他植物中僅有少數(shù)RRTZF基因的功能獲得研究。水稻中，僅有OsTZF1和OsTZF2（OsDOS）兩個復(fù)制基因的功能研究較為深入。OsTZF1正向調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)、負向調(diào)節(jié)PHYB和PHYC介導(dǎo)的紅光與遠紅光反應(yīng)、參與鹽脅迫反應(yīng)及JA誘導(dǎo)的葉片衰老[4];OsTZF2（OsDOS）通過JA誘導(dǎo)途徑負向調(diào)控水稻葉片衰老[5]。通過前期研究發(fā)現(xiàn)OsTZF9基因在水稻的胚乳中特異性表達[6-7]，為了進一步了解OsTZF9基因的功能，本研究構(gòu)建了OsTZF9基因過表達載體，獲得了過表達轉(zhuǎn)基因植株并進行系統(tǒng)的田間表型調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因受體材料為粳稻Oryza sativa L.ssp.Japonica日本晴Nipponbare。

大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404、質(zhì)粒pCXUN和pCXUNTZF9，均由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室保存。pCXUN為植物過表達骨架載體， TDNA區(qū)包含攜帶由35S啟動子驅(qū)動的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因及Ubiquitin啟動子（用于啟動目的基因），pCXUNTZF9為OsTZF9基因過表達載體。

1.2 載體構(gòu)建

以日本晴基因組DNA為模板，用高保真酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）PCR擴增OsTZF9基因全長，并用普通Taq酶進行加A處理。所用的PCR引物為OsTZF9F：5′CAAAGCACATTGCAAACACAG 3′和OsTZF9R：5′GTAACACACCCATCTACACGAAG3′。

用Xcm I 酶切pCXUN質(zhì)粒，獲得3′末端突出1個T堿基的線性骨架載體，通過TA克隆法與上述OsTZF9基因全長PCR產(chǎn)物連接，挑單克隆測序獲得連接正確的OsTZF9基因植物過表達載體，并通過電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以日本晴成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為農(nóng)桿菌侵染材料，經(jīng)過抗性愈傷組織的篩選、分化及生根獲得再生水稻植株，相關(guān)的培養(yǎng)基及試驗步驟參照文獻[8]。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測

葉片浸泡潮霉素方法篩選轉(zhuǎn)基因植株：田間采取新鮮分蘗期待檢測水稻植株葉片，浸泡于50 mg·L-1的潮霉素溶液中，28℃光照培養(yǎng)3～5 d后統(tǒng)計水稻對潮霉素的抗感情況，葉片無褐斑為抗，即為轉(zhuǎn)基因植株;葉片出現(xiàn)褐斑為感，即為非轉(zhuǎn)基因植株。

PCR擴增方法篩選轉(zhuǎn)基因植株：以CTAB法[9]提取的水稻葉片基因組總DNA為模板，用引物TZF9T1：5′TAGCCCTGCCTTCATACGC 3′和TZF9T2：5′TTGGTCGGGTCAATGGTTA? 3′進行PCR擴增。擴增片段247 bp，包括Ubiquitin啟動子和目的基因區(qū)域的DNA片段。PCR擴增程序為：94℃，預(yù)變性5 min;{94℃，45 s;56℃，45 s;72℃，45 s}，35個循環(huán);72℃，延伸8 min。

1.5 田間種植

選取OsTZF9基因過表達株系3個克?。∣T9-3、OT9-20和OT9-40）、野生型日本晴及轉(zhuǎn)基因陰性分離株進行田間種植，每份材料種植成一個小區(qū)，每個小區(qū)種植6行，每行栽7株苗，種植密度為20 cm×20 cm。

1.6 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、穗長和結(jié)實率的調(diào)查：成熟后每個小區(qū)隨機選取非邊行的5～10個具有代表性的單株進行分析，以它們的平均值作為每個株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)值。每株有效穗數(shù)統(tǒng)計標準為結(jié)實籽粒大于或等于5粒的所有稻穗，測量所有有效穗穗長的平均值為該株的穗長，所有有效穗的結(jié)實率為該單株的結(jié)實率。

抽穗期調(diào)查：水稻抽穗時，每2 d調(diào)查1次各個小區(qū)中每個單株的始穗期，以每株主穗抽出1 cm作為該株始穗的標準，以從播種到始穗的天數(shù)為抽穗期。

粒重稱量：每個小區(qū)選取6個具有代表性的單株，脫粒后于烘箱中烘干至恒重，每個單株飽滿種子重量除以各自種子粒數(shù)，然后再乘以1000即獲得每個單株千粒重，6個單株千粒重的平均值即為該株系的粒重。

1.7 統(tǒng)計分析

利用SPSS軟件進行單因素方差分析，并用鄧肯方法進行多重比較。結(jié)實率先通過反正弦化后再進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsTZF9基因過表達載體的構(gòu)建

以日本晴基因組DNA為模板，用高保真酶PCR擴增獲得了以日本晴為背景的OsTZF9基因全長PCR產(chǎn)物， PCR產(chǎn)物膠回收后用普通Taq酶加A尾巴，通過TA克隆方法與pCXUN線性載體連接，經(jīng)測序獲得了正向連接且序列正確的植物過表達載體，命名為pCXUNTZF9（圖1）。通過電激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404，挑取單克隆進行菌液PCR，獲得了能擴出目的片段的陽性單克隆并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 過表達轉(zhuǎn)基因植株的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將pCXUN-TZF9載體導(dǎo)入日本晴成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，共獲得了再生轉(zhuǎn)化植株50個克隆，每個克隆各選取2個單株共100個單株種植于大棚中。對各個單株進行葉片潮霉素抗感性試驗，結(jié)果顯示：50個克隆100個單株中共有20個克隆39個單株（其中1個克隆只檢測到1個單株具有潮霉素抗性）具有潮霉素抗性。

進一步對具有潮霉素抗性的39個單株葉片基因組DNA進行PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅6個克隆12個單株能擴出明亮的目的條帶（圖2）。對具有明亮條帶的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果均為預(yù)期的目的序列。以上結(jié)果表明了OsTZF9基因過量表達載體的TDNA區(qū)成功地插入到水稻基因組中。

2.3 OsTZF9基因過量表達對水稻主要農(nóng)藝性狀的影響

系統(tǒng)調(diào)查OsTZF9基因過表達株系的田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，結(jié)果顯示，在分析的5個性狀中，除結(jié)實率外，3個不同轉(zhuǎn)基因克隆的過表達株系的其他4個性狀均與野生型日本晴（CK）存在顯著差異（表1）。過表達株系的平均株高為52.2～61.0 cm，比對照低8.0～16.8 cm;平均分蘗數(shù)為12.9～14.2個，比對照減少5.2～6.5個;平均有效穗數(shù)為10.8～14.1個，比對照減少4.0～7.3個;平均穗長為12.0～13.4 cm，比對照減少2.1～3.5 cm?？梢?，OsTZF9基因過量表達對水稻的株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和穗長具有抑制作用。

2.4 OsTZF9基因過表達對水稻粒重的影響

選取3個不同克隆的OsTZF9基因過表達T2代純合株系種植于田間中，對成熟期收獲的不同株系的種子進行千粒重稱量發(fā)現(xiàn)，OsTZF9基因過表達株系的平均千粒重15.5～21.5 g，均顯著低于野生型日本晴（CK）（23.3 g），其中OT920株系的千粒重最小，比對照減少7.8 g（圖3）。對上述3個克隆OsTZF9

基因過量表達株系繼續(xù)種植T3代，粒重分析結(jié)果顯示T3代的平均千粒重均明顯低于對照（圖4），說明了OsTZF9基因過量表達降低水稻粒重具有遺傳穩(wěn)定性。

2.5 OsTZF9基因過量表達對水稻開花的影響

前期田間性狀調(diào)查時發(fā)現(xiàn)OsTZF9基因過表達植株具有推遲水稻開花的現(xiàn)象，進一步選取3個不同克隆的OsTZF9基因過表達T1代植株進行抽穗期調(diào)查，同時以轉(zhuǎn)基因植株后代陰性分離株為對照，結(jié)果顯示OsTZF9基因過表達植株的平均抽穗期為68～85 d，比對照推遲14～31 d（圖5）。繼續(xù)跟蹤調(diào)查OsTZF9基因過表達T2代植株抽穗期發(fā)現(xiàn)，3個不同克隆OsTZF9基因過表達植株的抽穗期均比陰性分離株長（圖6）。以上結(jié)果，說明了OsTZF9基因過量表達具有推遲水稻開花的作用。

3 討論與結(jié)論

植物RRTZF蛋白是植物生長發(fā)育及脅迫反應(yīng)的一個潛在調(diào)節(jié)因子。擬南芥中， AtTZF2和AtTZF3基因過表達植株對ABA超敏感和耐旱性[10]，種子特異表達基因AtTZF4、AtTZF5和 AtTZF6是ABA、GA和光敏色素B（phyB）介導(dǎo)的種子萌發(fā)的負調(diào)控因子[11]。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsTZF9蛋白與谷蛋白基因GluB1啟動子區(qū)結(jié)合，OsTZF9基因RNAi植株種子中的總氮含量比對照高。本研究發(fā)現(xiàn)，OsTZF9基因過表達植株的千粒重下降。這些結(jié)果暗示了OsTZF9基因是一個水稻粒重和種子蛋白質(zhì)含量的負調(diào)控因子。

擬南芥RRTZF基因過量表達研究發(fā)現(xiàn)，不同RRTZF基因過表達植株具有一因多效的現(xiàn)象，且存在著一些相似表型[13]。如AtTZF1基因過表達[14]時，具有AtTZF11和AtTZF10基因過表達植株的抗寒和抗旱性，同時還具有AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6基因過表達植株種子萌發(fā)推遲的現(xiàn)象;AtTZF4、AtTZF5和AtTZF6基因在擬南芥中組成型表達[11]時，出現(xiàn)了一系列和AtTZF1基因過表達類似脅迫耐受表型。水稻中，OsTZF1 和OsTZF2基因過表達植株均表現(xiàn)多種表型[4-5]，而且它們均具有推遲水稻葉片衰老的現(xiàn)象。本研究也發(fā)現(xiàn)，水稻胚乳強優(yōu)勢表達OsTZF9基因組成型過表達時具有降低株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、穗長和粒重及推遲抽穗等多效表型，它與OsTZF2基因過表達植株均具有推遲水稻抽穗的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明了植物RRTZF基因的功能可能具有一定的冗余現(xiàn)象，同時也暗示了它們可能通過一個保守的基本分子機制起著類似的作用。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）