賀成光朱篩成陳大業(yè)

(1.鹽城市婦幼保健院 小兒胸心外科, 江蘇鹽城 224000; 2.鹽城市婦幼保健院兒童心臟內(nèi)科, 江蘇 鹽城 224000)

支氣管肺發(fā)育不良( bronchopulmonary dysplasia, BPD)好發(fā)于早產(chǎn)兒中,該病是由因急性呼吸窘迫而進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械通氣干預(yù)以及輔助氧療導(dǎo)致的肺泡和肺內(nèi)血管發(fā)育受阻的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,其病死率較高,即使經(jīng)治療存活幼兒也極易承受反復(fù)呼吸到感染、肺動(dòng)脈高壓、哮喘、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、生長(zhǎng)遲緩以及喂養(yǎng)困難等合并多種并發(fā)癥,給患兒家庭以及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。由于該病的病理機(jī)制較為復(fù)雜,尚未完全闡明,因此BPD 成為國(guó)際上新生兒科的一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。研究表明[2]大量的肺泡上皮細(xì)胞的異常凋亡致使肺泡結(jié)構(gòu)破壞是BPD 患兒肺損傷的基本病理改變。Zhang 等[3]研究表明抑制肺泡上皮細(xì)胞的凋亡能明顯改善急性肺損傷大鼠的肺損傷病理。Shah 等[4]研究證實(shí)多種蛋白因子參與BPD 肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。楊敏等[5]研究發(fā)現(xiàn)BPD 患兒支氣管灌洗液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factorβ1, TGF-β1)、克拉拉細(xì)胞分泌蛋白 16(clara cell secretory protein, CC16)、肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面抗原-6(krebs yon denlungen-6, KL-6)存在異常的現(xiàn)象,可能參與患兒肺損傷的修復(fù)以及上皮細(xì)胞的凋亡。但未闡明 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)與肺組織細(xì)胞的凋亡的機(jī)制。本研究通過建立新生大鼠BPD 模型,通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6的表達(dá),以及肺組織細(xì)胞的凋亡情況,來探討TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)對(duì)肺組織細(xì)胞凋亡的影響,從而為BPD 的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)新生 SD 雄性大鼠,1 日齡,體重 6.35 ～9.05 g,共計(jì)48 只,由江蘇神龍藥業(yè)有限公司提供[SCXK(蘇)2017-0007],飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)[SYXK(蘇)2019-0024]。本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在3R 原則的指導(dǎo)下給與動(dòng)物人道主義關(guān)懷,本研究經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2020-079)。

1.2 主要試劑與儀器

TGF-β1、CC16、KL-6 抗體(德國(guó) Rebstock 公司);兔抗大鼠磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗體(美國(guó)Santa公司);免疫組化試劑盒(南京建成生物有限公司);蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司);脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick labeling, TUNEL) 染色試劑盒(德國(guó)Roche 公司)。

LIOOS600T 生物顯微鏡(日本尼康公司);-80℃深冷冰箱(德國(guó)維根斯公司);Leica RM2135 組織切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司);高速低溫離心機(jī)(北京六一儀器廠);OM-25ME 數(shù)字測(cè)氧儀(美國(guó)OMEGA公司);LVEM5 低電壓臺(tái)式透射電鏡(加拿大Delong America 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BPD 模型構(gòu)建和分組處理

按隨機(jī)數(shù)字表法將新生鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組,每組24 只。BPD 的造模方法[6]:將新生鼠置于自制的密封的玻璃氧箱中,溫度在22℃～26℃,濕度在50%～60%,鈉石灰平鋪箱底以吸附CO2,平鋪?zhàn)兩枘z以吸收水分,以數(shù)字測(cè)氧儀控制氧氣維持在80%～85%之間。模型組的氧箱每日定點(diǎn)開箱1 h,以更換鈉石灰以及變色硅膠。對(duì)照組新生鼠置于空氣中。所有新生鼠均由母鼠喂養(yǎng),所有母鼠每日以干凈水源、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng);為防止母鼠在高氧環(huán)境中中毒死亡,每日定時(shí)交換模型組和對(duì)照組母鼠。記錄兩組新生鼠的體重、進(jìn)食、死亡情況。每組在 7 d,14 d,21 d 時(shí)(簡(jiǎn)稱為 7 d 模型組、14 d 模型組、21 d 模型組)隨機(jī)選出8 只新生鼠,誘導(dǎo)麻醉處死,留取血5 mL,打開胸腔無菌取出其肺部組織,置入深冷冰箱,待測(cè)。

1.3.2 ELISA 檢測(cè)各組新生鼠的血清中TGF-β1、CC16、KL-6 的水平

采用ELISA 試劑盒檢測(cè)各組新生鼠的血清中TGF-β1、CC16、KL-6 的水平,采用邁瑞全自動(dòng)酶標(biāo)儀MR-96 A 進(jìn)行分析。

1.3.3 HE 染色觀察各組新生大鼠肺組織病理學(xué)改變

取出各組20%第7、14、21 天處死的大鼠肺臟組織,采用10%的甲醛固定24 h 切片,HE 染色觀察,光鏡下觀察病理改變。使用圖像分析軟件分析輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radial alveolar count, ROC),肺泡平均截距(mean linear intercept, MLI)[7]。

1.3.4 電鏡觀察各組新生大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變

取出10%第7、14、21 天處死的大鼠肺組織,制成超薄組織切片:采用2.5%聚甲醛預(yù)固定15 min,1%鋨酸固定20 min,環(huán)氧樹脂浸透包埋切片,醋酸雙氧鈾(uranyl acetate)及枸櫞酸鉛(lead citrate)染色,制成50 nm 切片,干燥后載與銅網(wǎng)上,電鏡觀察新生大鼠肺組織超微病理結(jié)構(gòu)改變。

1.3.5 TUNEL 染色檢測(cè)各組新生大鼠肺組織中的細(xì)胞凋亡

取出10%第7、14、21 天處死的大鼠肺組織,固定,冰凍切片,二甲苯浸洗,梯度乙醇浸洗,風(fēng)干后3%雙氧水-甲醇浸泡,清洗,依次采用0.1%TritonX-100,0.1%緩沖液浸泡,清洗后,加入TUNNEL 反應(yīng)液,暗濕盒反應(yīng),漂洗,脫水,透明,封片,熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.6 免疫組化檢測(cè)各組新生大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)

取出20%第7、14、21 天處死的大鼠肺組織,10%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片,脫蠟,PBS 緩沖液修復(fù)。雙氧水浸泡,室溫下孵育,封閉,PBS 沖洗3 次,加入一抗(1∶500),4℃過夜孵育,次日沖洗干凈,分別加入二抗(1∶500),室溫孵育。顯色,蘇木素輕度復(fù)染,乙醇梯度脫水,二甲苯浸泡,中性樹膠封片,鏡檢觀察,在顯微鏡下目標(biāo)蛋白被染成棕黃色顆粒[8]。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)各組新生大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)水平

取出20%第7,14,21 天處死的大鼠肺組織,采用常規(guī)方法提取目標(biāo)蛋白 TGF-β1、CC16、KL-6,經(jīng)BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后,準(zhǔn)確量取50 μg,電泳將蛋白分離,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,以(1 ∶1500)比例稀釋后,維持4℃過夜孵育,次日,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗,經(jīng)顯色,曝光、顯影、定影后,以GAPDH 為內(nèi)參來表示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0 軟件,作圖工具采用Graphpad5.01,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組新生鼠一般情況比較

對(duì)照組新生鼠精神狀態(tài)良好,斷奶后能夠自主進(jìn)食,呼吸正常,皮毛濃密且富有光澤,未有死亡鼠出現(xiàn),存活率100%,體重明顯增加。模型組新生鼠精神狀態(tài)不加,容易煩躁,反應(yīng)速度較慢,進(jìn)食較少,皮毛粗糙,暗淡,呼吸急促,體重增加量明顯比對(duì)照組少(P<0.05),有新生鼠因高氧而死亡,存活率為(60.35±3.42)%,見圖1。

2.2 兩組新生鼠肺組織損傷病理學(xué)改變

HE 染色結(jié)果如圖2 所示,正常組新生大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列規(guī)整,未見充血、擴(kuò)張、出血以及纖維增生現(xiàn)象,肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁厚度均勻,無水腫、增寬、滲出等現(xiàn)象,隨著日齡增長(zhǎng),肺泡大小趨向一致,肺泡間隔以及各級(jí)支氣管管腔內(nèi)均未內(nèi)未發(fā)現(xiàn)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、分泌物滲出等現(xiàn)象。7 d 模型組新生大鼠肺組織纖維增生明顯,間質(zhì)水腫明顯,肺泡腔明顯變小,肺泡壁厚度不均一,間隔明顯增寬,腔內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞填充;14 d模型組新生大鼠肺組織正常結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)實(shí)質(zhì)性灶點(diǎn)破壞,肺泡腔內(nèi)的炎性細(xì)胞明顯增多,肺間隔進(jìn)一步加寬;21 d 模型組新生大鼠肺組織灶點(diǎn)性實(shí)變?cè)龆?局部呈現(xiàn)片狀病變,肺泡結(jié)構(gòu)的損傷進(jìn)一步加重,小肺泡數(shù)量銳減,肺間質(zhì)內(nèi)膠原沉積增多。兩組大鼠的RAC 和MLI 比較如圖3 所示,與正常組相比,模型組大鼠肺組織在7 d,14 d,21 d 的RAC 明顯減少(P<0.05),MLI 明顯增加(P<0.05)。

注:A:正常組;B:模型組。與正常組相比,?P<0.05。圖1 兩組大鼠體重以及存活率比較Note.A, Normal group.B, Model group.Compared with normal group, ?P<0.05.Figure 1 The comparison of body weight and survival rate of two groups of rats

2.3 兩組新生鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷改變

電鏡觀察結(jié)果如圖4 所示,正常組新生大鼠肺組織上皮細(xì)胞形狀規(guī)則,排列規(guī)整,Ⅱ型肺泡細(xì)胞板層小體清晰可辨,上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)規(guī)整,隨著日齡的增加,成熟肺泡數(shù)量明顯增多;7 d 模型組新生大鼠肺組織的板層小體出現(xiàn)排空,上皮細(xì)胞的微絨毛結(jié)構(gòu)或缺失或破損;14 d 模型組新生大鼠的板層小體出已經(jīng)基本排空,線粒體空泡樣變性明顯,嵴結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷;21 d 模型組新生大鼠的板層小體基本消失,上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)損傷更加嚴(yán)重,數(shù)量驟減,線粒體空泡樣變性加劇,嵴結(jié)構(gòu)明顯減少,或缺損,或消失。

2.4 TUNEL 染色檢測(cè)各組新生大鼠肺組織中的細(xì)胞凋亡

TUNEL 染色結(jié)果如圖5 所示,與正常組相比,模型組新生大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率隨日齡的增加明顯增加(P<0.05)。

2.5 各組新生大鼠新生鼠的血清中 TGF-β1、CC16、KL-6 的水平

ELISA 檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示,與正常組相比,模型組新生大鼠血清中TGF-β1、KL-6 的含量隨日齡增加而明顯增加(P<0.05),CC16 的含量隨日齡增加而明顯降低(P<0.05)。

2.6 免疫組化Western blot 檢測(cè)各組新生大鼠肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)

免疫組化結(jié)果如圖7 ～9 所示:與正常組相比,模型組大鼠肺組織TGF-β1、KL-6 的陽性細(xì)胞比例隨日齡增加明顯升高(P<0.05),CC16 的陽性細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)。

注:A:正常組;B1:7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。圖2 HE 染色結(jié)果Note.A, Normal group.B, Model group.B1, 7 d model group.B2, 14 d model group.B3, 21 d model group.Figure 2 The results of HE staining

2.7 Western blot 檢測(cè)各組新生大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)水平

Western blot 結(jié)果如圖10 所示:與正常組相比,模型組大鼠肺組織TGF-β1、KL-6 的表達(dá)隨日齡增加明顯升高(P<0.05),CC16 的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

注:A:正常組;B1:7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。與正常組相比,?P<0.05。圖3 P 兩組新生大鼠RAC 和MLI 比較Note.A,Normal group.B,Model group.B1,7 d model group.B2,14 d model group.B3,21 d model group.Compared with normal group,?P<0.05.Figure 3 The comparison of RAC and MLI of two groups of newborn rats

2.8 模型組肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)與其肺組織細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

模型組新生鼠肺組織中 TGF-β1、KL-6 的表達(dá)與肺組織的細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.977、0.970,P均=0.000),CC16 的表達(dá)與細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-0.982,P=0.000),見圖11。

3 討論

作為一種在低胎齡產(chǎn)兒中最常見的慢性肺部疾病,BPD 的主要臨床病理[9]改變表現(xiàn)為肺泡數(shù)量減少,體積增加,肺泡次級(jí)間隔縮短等肺泡結(jié)構(gòu)破壞致使肺泡和肺微血管發(fā)育障礙,肺功能異常。盡管近來的圍生醫(yī)學(xué),氧療技術(shù),新生兒的管理技術(shù)的不斷提高以及機(jī)械通氣策略的改進(jìn),但是BPD 仍無根治性治療措施,在新生兒中具有較高的致殘率和致死率[10]。因此深入研究BPD 的發(fā)病機(jī)制,對(duì)臨床上BPD 的治療以及遠(yuǎn)期預(yù)后影響深遠(yuǎn)。

注:A:正常組;B1:7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。圖4 電鏡觀察結(jié)果Note.A, Normal group.B, Model group.B1, 7 d model group.B2, 14 d model group.B3, 21 d model group.Figure 4 The observation results under electron microscope

注:A:正常組;B1 ∶7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。與正常組相比,?P<0.05;與 7 d 模型組相比,#P<0.05;與 14 d 模型組相比,##P<0.05。下同。圖5 TUNEL 染色結(jié)果Note.A, Normal group.B, Model group.B1, 7 d model group.B2, 14 d model group.B3, 21 d model group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the 7 d model group, #P<0.05.Compared with the 14 d model group, ##P<0.05.The same as below.Figure 5 The results of TUNEL staining

圖6 各組新生大鼠血清中 TGF-β1、CC16、KL-6 的水平Figure 6 The levels of TGF-β1, CC16 and KL-6 in serum of newborn rats in each group

圖7 免疫組化檢測(cè)大鼠肺組織中TGF-β1 的表達(dá)Figure 7 Immunohistochemical detection of the expression of TGF-β1 in the lung tissues of rats

圖8 免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺組織中CC16 的表達(dá)Figure 8 Immunohistochemical detection of the expression of CC16 in the lung tissues of rats

圖9 免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺組織中KL-6 的表達(dá)Figure 9 Immunohistochemical detection of the expression of KL-6 in the lung tissues of rats

圖10 Western blot 結(jié)果Figure 10 Results of Western blot

圖11 模型組大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)與肺組織的細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性Figure 11 Correlation between the expression of TGF-β1, CC16, KL-6 in the lung tissue of the model group and the apoptosis rate of the lung tissue

高氧機(jī)械持續(xù)通氣是危重早產(chǎn)兒搶救中的常用措施,但由于早產(chǎn)兒的肺泡和肺微血管的發(fā)育尚未完善,長(zhǎng)時(shí)間的高氧暴露會(huì)產(chǎn)生高氧肺損傷,誘發(fā)BPD[11]。本研究通過高濃度氧暴露來建立新生大鼠BPD 模型,分別在7 d,14 d,21 d 處死新生鼠進(jìn)行追蹤觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組健康生長(zhǎng),發(fā)育良好,未有死亡鼠出現(xiàn),存活率100%。模型組新生鼠精神不振,發(fā)育遲緩,體重增加量不明顯,有新生鼠因高氧而死亡,存活率僅有(60.35±3.42)%。RAC是反映哺乳動(dòng)物終末呼吸時(shí)成熟肺泡的數(shù)量,是衡量肺發(fā)育成熟與否的重要指標(biāo);代表肺泡腔內(nèi)徑大小的MLI 是評(píng)價(jià)肺間質(zhì)水腫程度的常用指標(biāo)[12]。本研究中模型組的HE 病理顯示和超微結(jié)構(gòu)觀察模型組新生鼠的肺組織損傷、肺部超微結(jié)構(gòu)損傷程度隨氧暴露時(shí)間的持續(xù)而逐漸加重。與正常組相比,模型組大鼠肺組織在7 d,14 d,21 d 的RAC 明顯減少(P<0.05),MLI 明顯增加(P<0.05),說明隨氧暴露的時(shí)間的延長(zhǎng),模型組新生鼠的成熟肺泡的數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)肺發(fā)育不良的癥狀。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示[13]肺泡上皮細(xì)胞的異常凋亡是BPD 患兒肺泡數(shù)量減少的關(guān)鍵因素。Cai 等[14]研究證實(shí)抑制肺組織尤其是肺泡上皮細(xì)胞的凋亡,能夠明顯改善早產(chǎn)兒BPD 肺損傷病理,促進(jìn)肺組織的發(fā)育。但是針對(duì)BPD 潛在的細(xì)胞凋亡機(jī)制尚不明確,國(guó)內(nèi)外眾多的研究學(xué)者致力于闡明BPD 的分子病理發(fā)生機(jī)制。TGF-β1 是多種器官包括肺、肝、腎等致纖維化的關(guān)鍵因子。研究顯示[15]早產(chǎn)患兒肺組織中存在TGF-β1 過度表達(dá)的現(xiàn)象。Jin 等[16]研究顯示異常表達(dá)的TGF-β1 促進(jìn)新生大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的趨化活性,加重新生大鼠肺組織的纖維化損傷。CC16 是細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞分泌的具有抗炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等生物活性的肺相關(guān)性蛋白。Lin 等[17]研究報(bào)道血清中CC16 的水平是評(píng)價(jià)哮喘、慢性阻塞性肺病以及肺感染等肺部疾病中肺-血屏障通透性,反映肺泡毛細(xì)血管損傷的重要指標(biāo)。Guzmán-Bárcenas 等[18]報(bào)道 CC16 的表達(dá)可作為生物標(biāo)志物,對(duì)BPD 的治療以及遠(yuǎn)期預(yù)后具有潛在的價(jià)值。KL-6 是在在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中定位表達(dá)的炎性因子。Dilli 等[19]臨床研究證實(shí)血漿中KL-6 的水平對(duì)于早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良的預(yù)測(cè)具有潛在的診斷價(jià)值。本研究中研究發(fā)現(xiàn),模型組新生鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率隨氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,血清中 TGF-β1、CC16、KL-6 的水平以及肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達(dá)隨之升高。相關(guān)性分析顯示模型組新生鼠肺組織中TGF-β1、KL-6的表達(dá)與肺組織的細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.977、0.970,P均=0.000),CC16 的表達(dá)與細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-0.982,P=0.000)。

綜上所述,TGF-β1、CC16、KL-6 參與 BPD 肺組織的細(xì)胞凋亡。這為下一步開展BPD 的基因治療提供了新的靶向位點(diǎn),但是如何控制血清中TGF-β1、CC16、KL-6 的水平,以及如何針對(duì) TGF-β1、CC16、KL-6 位點(diǎn)開展對(duì)BPD 的個(gè)體化治療還需更深入的研究。