張曉頔 張益奇,2,3 朱 凱 郭麗平 陳 康,2 戴志遠,2,3,*

(1 浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310035；3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116000)

2019年世界水產(chǎn)總量超2億t，我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6 480萬t[1]。水產(chǎn)品在加工過程中會產(chǎn)生頭、皮、骨、鱗、內(nèi)臟等副產(chǎn)物，占總重的40%～55%。這些副產(chǎn)物除部分被用作化肥和飼料外，其余大部分作為垃圾被丟棄，不僅造成了嚴重的資源浪費，而且給環(huán)境保護帶來了極大的壓力[2]。因此，亟待開發(fā)新的有效技術(shù)，讓水產(chǎn)品副產(chǎn)物得以高附加值化利用。魚副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)，水解后為多肽或小分子肽類，經(jīng)分離純化后得到的特定肽段具有某些生物活性，更具經(jīng)濟效益，也可在一定程度上改善環(huán)境問題[3]。蛋白酶解物具有良好的生物活性，尤其是抗氧化活性肽能夠清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基等，具有防止機體機能受損，維持正常生長代謝的功能[4]，已然成為近年來學界的研究熱點。

在全球加工的所有魚類中，三文魚(Salmon)占比較大，近年來被大量進口到我國。三文魚富含蛋白質(zhì)、ω-3脂肪酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是近年來深受消費者喜愛的生身食品，但三文魚加工過程中也會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物。三文魚皮蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成平衡[5]，是制備酶解物的優(yōu)良資源。酶解是獲得具有抗氧化活性三文魚皮肽的主要方式，通過酶解改性，可提高三文魚皮蛋白的抗氧化活性并改變其功能特性[6]。同時，有研究表明在酶解過程中，蛋白酶的選擇對于蛋白酶解物抗氧化活性的高低至關(guān)重要。但目前關(guān)于三文魚皮酶解物的研究多采用特定的蛋白酶或酶制劑進行酶解，而針對不同蛋白酶對其抗氧化活性和功能特性的差異研究還不夠全面。因此，本研究采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復合蛋白酶3種內(nèi)切酶和風味蛋白酶(外切酶)對三文魚皮進行酶解，對比不同蛋白酶的酶解效果以及4種三文魚皮酶解物的抗氧化活性與功能特性，以期為三文魚皮在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚皮，悅勝行貿(mào)易有限公司；中性蛋白酶(Neutrase?0.8 L)、堿性蛋白酶(Alcalase?AF 2.4 L)、風味蛋白酶(Flavourzyme?500 MG)、復合蛋白酶(Protamex?)，丹麥Novozymes公司；碳酸酐酶、細胞色素C、抑肽酶、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、菲洛嗪(Ferrozine)，美國Sigma公司；BCA(bicinchoninic acid)試劑盒，南京碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；400Y多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Spectra MAX 190 酶標儀，美國Molecular Devices公司；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚皮前處理 將新鮮魚皮殘留的碎肉和脂肪剔除后清洗干凈，切成小塊，置于45℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，用粉碎機粉碎成40目的顆粒，密封保存。

1.3.2 酶解工藝 三文魚皮粉末與蒸餾水按1∶6(m∶v)的比例混合勻漿，按表1所設(shè)計的試驗條件調(diào)節(jié)混合液的溫度和pH值，將4種蛋白酶分別按8 000 U·g-1的比例加入到混合液中。在酶解過程中通過連續(xù)加入0.1 mol·L-1HCl或NaOH來維持反應(yīng)液的最適pH值。酶解反應(yīng)4 h后，95℃加熱10 min滅活蛋白酶，8 000 r·min-1離心10 min。去除上層油脂，收集上清液冷凍干燥后-20℃儲存，備用。

表1 蛋白酶酶活、最適溫度和最適pH值

1.3.3 水解度(hydrolysis degree，DH)的測定 采用pH-stat法[6]測定DH，按照公式計算DH：

(1)

式中，B為酶解過程中消耗的NaOH體積，mL；Nb為NaOH濃度，mol·L-1；Mp為底物中蛋白質(zhì)總量，g；α為α氨基的平均解離度；htot為底物中蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)。

1.3.4 三氯乙酸可溶性氮(trichloroacetic acid-soluble nitrogen，TCA-NSI)得率的測定 利用20% TCA沉淀蛋白并結(jié)合BCA試劑盒測定酶解物中TCA-NSI得率[7]。

1.3.5 分子質(zhì)量分布的測定 參照董燁等[7]的方法，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測定酶解物的分子質(zhì)量。色譜柱為TSK-gel G2000SWxl(7.8 mm×30 mm)，流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(v∶v∶v)，柱溫：30℃，流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL。樣品質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1，0.45 μm的濾膜過濾。以碳酸酐酶(29 000 Da)、細胞色素C(12 400 Da)、抑肽酶(6 500 Da)和HHL(429 Da)為標準品作分子質(zhì)量校正曲線。將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線計算方程，得出酶解樣品的分子質(zhì)量及分布范圍。

1.3.6 體外抗氧化活性的測定

1.3.6.1 羥基自由基(·OH)清除率的測定 依次加入0.2 mL超純水、0.05 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、0.2 mL樣品溶液、0.05 mL 9 mmol·L-1FeCl2溶液和0.05 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液，混勻后于37℃反應(yīng)30 min，在510 nm波長處測吸光度值[8]。根據(jù)公式計算·OH清除率：

(2)

式中，A1為樣品的吸光度值；A2為0.05 mL超純水代替FeCl2溶液測得的吸光度值；A3為0.2 mL超純水代替樣品溶液測得的吸光度值。

1.3.6.2 Fe2+螯合活性的測定 取4.7 mL樣品溶液與0.1 mL 20 mmol·L-1FeCl2溶液混合均勻，室溫靜置反應(yīng)30 min，加入0.2 mL 5 mmol·L-1Ferrozine，室溫反應(yīng)10 min，在562 nm波長處測吸光度值[2]。根據(jù)公式計算Fe2+螯合活性：

(3)

式中，A1為樣品的吸光度值；A2為超純水代替樣品溶液測得的吸光度值。

1.3.6.3 還原力的測定 取1.0 mL樣品分別與2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mmol·L-1，pH值6.6)和2.5 mL 1%(m/v)K2Fe(CN)6混合，于50℃反應(yīng)20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。反應(yīng)液以6 000 r·min-1離心5 min，取2.5 mL上清液加入1 mL 0.1% FeCl3溶液，于50℃反應(yīng)10 min。在700 nm波長處測吸光度值，反應(yīng)物的吸光度值增加表示還原力增加[6]?？瞻捉M為蒸餾水代替FeCl3溶液。

(4)

式中，V1為樣品組的鄰苯三酚自氧化速率；V2為空白組的鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.7 功能特性的評價

1.3.7.1 溶解性的測定 取0.20 g樣品溶解于20 mL蒸餾水中，攪拌10 min后，5 000 r·min-1離心10 min，采用BCA試劑盒測定上清液的蛋白質(zhì)含量[10]。根據(jù)公式計算溶解性：

(5)

式中，A為上清液蛋白質(zhì)含量；B為樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3.7.2 持水及持油性的測定 取1 g樣品分散在10 mL水或色拉油中，振蕩3次，每次2 min，放置2 h后4 000 r·min-1離心15 min，將上清液倒出后稱重[11]。根據(jù)公式計算持水性和持油性：

(6)

式中，m為樣品的質(zhì)量，g；m1為離心管和沉淀物的總質(zhì)量，g；m2為離心管和樣品的總質(zhì)量，g。

1.3.7.3 乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index，ESI) 根據(jù)Noman等[11]的濁度法測定。取蛋白濃度為10 mg·mL-1的溶液與5 mL色拉油混勻，12 000 r·min-1均質(zhì)2 min后，從底部吸取樣液0.1 mL，用10 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液進行稀釋。分別于0和10 min在500 nm波長處測定其吸光度值，以SDS溶液作為空白對照。根據(jù)公式計算EAI和ESI：

(7)

(8)

式中，dil為稀釋倍數(shù)；A為乳化液的吸光度值；C為樣品濃度，g·mL-1；φ為乳化液中油相的比例；A0為初始乳化液的吸光度值；At為10 min時的吸光度值。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)，采用多重比較分析法對各組進行顯著性檢驗(P<0.05)，用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對三文魚皮酶解效果的影響

DH用來描述蛋白質(zhì)酶解的程度，DH值增加表示在酶解過程中裂解了更多的肽鍵。如圖1所示，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DH為20.18%，顯著高于其他組(P<0.05)，風味蛋白酶酶解產(chǎn)物DH最低。三文魚皮經(jīng)酶解后酶解物TCA-NSI得率顯著增加，且堿性蛋白酶酶解物TCA-NSI得率顯著高于其他組，風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的TCA-NSI得率最低。對DH和TCA-NSI得率進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物中DH與TCA-NSI得率呈正相關(guān)(r=0.984)。

注：不同字母表示同一指標間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 分子質(zhì)量分布情況

圖2為標準品相對分子質(zhì)量分布色譜圖，根據(jù)其對數(shù)與Kav值作曲線，得到標準曲線方程為y=-0.197 9x+6.857 6(R2=0.991 5)。

圖2 標準品相對分子質(zhì)量分布色譜圖

由表2可知，與未酶解相比，4種酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布總體表現(xiàn)為：樣品中含有大量的小分子肽(<3 000 Da)。4種蛋白酶酶解產(chǎn)物中多肽分子質(zhì)量分布表現(xiàn)出一定的差異性。堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解產(chǎn)物中低聚肽(<1 000 Da)含量分別達84.97%和65.71%；而中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解物中低聚肽含量只有32.76%和58.00%。根據(jù)酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量，三文魚皮的酶解效率從大到小依次為堿性蛋白酶>復合蛋白酶>中性蛋白酶>風味蛋白酶。

2.3 抗氧化活性

表2 三文魚皮酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

2.4 評價三文魚皮蛋白酶解物的功能特性

2.4.1 溶解性 溶解性是蛋白質(zhì)最重要的功能特性之一，其會進一步影響乳化性、流變性等功能特性[11]。溶解性與酶解物在食品、醫(yī)藥和其他工業(yè)中的應(yīng)用密切相關(guān)[10]。由圖4可知，三文魚皮經(jīng)蛋白酶酶解后，其產(chǎn)物的溶解性顯著增加，其中堿性蛋白酶酶解物的溶解性(87.21%)顯著高于其他組(P<0.05)。溶解度的增加可能與酶解后產(chǎn)物的粒徑變小，形成了更多小分子肽有關(guān)[13]，而且氨基酸形成的羧基和氨基，也會增加酶解物的親水性[14]。由于蛋白酶酶解三文魚皮時會產(chǎn)生特定的多肽譜，因此不同酶解產(chǎn)物具有不同的溶解性。

2.4.2 持水及持油能力 持水性和持油性是蛋白酶解物在工業(yè)應(yīng)用中的重要特性。由表4可知，所有蛋白酶均提高了三文魚皮酶解物的持水性和持油性。經(jīng)堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解的產(chǎn)物持水性較高，分別為26.92和23.87 g·g-1。持水性的差異可能與每種酶解物的肽組成，以及在持水性中起關(guān)鍵作用的、分子質(zhì)量不同的多肽有關(guān)[6]。結(jié)合前面的試驗結(jié)果表明，當酶解物DH處于較高水平時，其持油性較差。經(jīng)中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解的產(chǎn)物持油性較好，分別為4.67和3.35 g·g-1，顯著高于堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解物(P<0.05)。

注：不同大寫字母表示同一酶解物不同濃度間存在顯著差異(P<0.05)；不同小寫字母表示相同濃度下各酶解物間存在顯著差異(P<0.05)。

表3 三文魚皮酶解產(chǎn)物抗氧化活性的IC50值

表4 三文魚皮酶解產(chǎn)物的持水性和持油性

圖4 三文魚皮酶解產(chǎn)物的溶解性

2.4.3 乳化性能和乳化穩(wěn)定性 可通過測定乳液在500 nm波長處的濁度來衡量酶解產(chǎn)物的乳化性能[11]。三文魚皮酶解物是小分子肽段，含親水基團和疏水基團，因此可以促進水包油乳液的形成[15]。EAI越高，說明分散的脂肪球越細、數(shù)量越多，酶解物的乳化性能越好[13]。由圖5可知，不同酶解物的EAI和ESI均顯著高于未酶解的三文魚皮蛋白(P<0.05)。中性、堿性、風味和復合蛋白酶酶解物的EAI分別為空白組(4.92 m2·g-1)的3.0、2.2、2.6和2.6倍，ESI分別為空白組(20.95%)的3.8、3.0、4.0和3.3倍。

圖5 三文魚皮酶解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性

3 討論

三文魚皮蛋白中疏水性氨基酸占比達35.63%[16]，堿性蛋白酶可作用于疏水性或芳香族氨基酸的肽鍵，而風味蛋白酶僅將蛋白水解成較大片段的多肽[17-18]。因此三文魚皮堿性蛋白酶酶解物的DH相對較高，風味蛋白酶酶解物的DH較低。本研究表明酶解物的DH值與分子質(zhì)量呈負相關(guān)，與Alavi等[6]的研究結(jié)果一致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量與抗氧化活性呈負相關(guān)[19]，分子質(zhì)量小于3 000 Da的多肽具有良好的抗氧化活性[20]，這與本研究結(jié)果相一致。在本研究中，堿性蛋白酶酶解物的抗氧化活性顯著高于其他酶解物，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性主要取決于分子質(zhì)量和疏水性氨基酸的含量[21]，而堿性蛋白酶的酶切位點主要是疏水性氨基酸C末端的肽鍵，進而堿性蛋白酶提高了產(chǎn)物的抗氧化活性。Zhang等[22]利用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解鰱魚鰭發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較強的Fe2+螯合活性；Sinthusamran等[23]將鮭魚骨酶解后，堿性蛋白酶酶解物的DH和抗氧化活性顯著優(yōu)于其他組，這與本研究結(jié)果相一致。因此，從提高三文魚皮蛋白酶解物生物活性的角度出發(fā)，堿性蛋白酶是酶解三文魚皮的最佳用酶，中性蛋白酶和復合蛋白酶其次，風味蛋白酶的作用效果最差。

本研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的溶解性顯著高于其他酶解物。酶解物在高DH水平下的溶解性極好，這可能由于在較高的DH下，酶解物中更多的小分子肽類與周圍水分子形成更廣泛的氫鍵[6]。有研究表明，較高DH的酶解物會表現(xiàn)更優(yōu)的溶解性[24]，這與本試驗結(jié)果一致。這可能是由于隨著酶解時間的延長，大量極性基團(如-COOH和-NH2)被釋放出來，改善了酶解物的溶解性和吸水能力[25]。并且在反應(yīng)過程中，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)伸展性增大，也會加強水分子與蛋白分子間的相互作用[26]。持油性與蛋白質(zhì)的種類、來源、加工方法等因素有關(guān)，持油性會影響酶解物的乳化性[27-28]。Alavi等[6]研究表明，DH與持油性呈負相關(guān)，這與本試驗研究結(jié)果一致。Noman等[11]研究表明中華鱘酶解物的持水性和持油性分別為1.93 g·g-1、 2.59 g·g-1，本試驗酶解物的持水性高于中華鱘酶解物，但持油性低于中華鱘酶解物，這可能是原料不同，酶解過程中釋放出的親水性極性側(cè)鏈不同。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同酶解物的EAI和ESI均顯著高于未酶解的三文魚皮。在蛋白酶的作用下，三文魚皮蛋白結(jié)構(gòu)中的疏水基團逐漸暴露，有利于酶解物與油滴的結(jié)合，從而提高酶解物的乳化能力[29-30]。本研究中，堿性蛋白酶酶解物乳化性較差；中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解物因同時具有疏水和親水基團，可能會在乳化油滴的表面形成更具粘彈性的薄膜，因此表現(xiàn)出較好的乳化性[9]。本試驗各酶解物的EAI和ESI均與DH呈負相關(guān)，這與Lee等[31]和Amiza等[32]研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究分析了4種蛋白酶對三文魚皮蛋白水解程度和酶解產(chǎn)物抗氧化活性及功能特性的影響，結(jié)果表明，堿性蛋白酶酶解物的水解程度、抗氧化活性、溶解性和持水性均最高；中性蛋白酶酶解物的持油性和EAI最強；而風味蛋白酶酶解物雖然抗氧化活性最差，但ESI最高。綜上所述，堿性蛋白酶為制備三文魚皮蛋白抗氧化肽的最優(yōu)蛋白酶。下一步應(yīng)重點對其活性肽段進行分離、純化與鑒定，并進行細胞水平及動物體內(nèi)的抗氧化活性評價。