夏 菲,第五文博,陳 彤，王 樂,王曉玲,徐白璐，談娜娜

(寶雞文理學院 化學化工學院,陜西省植物化學重點實驗室,陜西 寶雞 721013)

黃芩(ScutellariaBaicalensisGeorgi.)為多年生草本唇形科黃芩屬植物，藥用其根，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效[1]。黃芩中的有效成分主要為黃酮類化合物，包括黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷和漢黃芩苷等[2]。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化和保護心血管等藥理作用[3-5]。

近年來，LC-MS被廣泛應(yīng)用于藥用植物黃酮類成分分析。如吳巍等[6]利用HPLC-ESI-MS/MS鑒別了2種互為同分異構(gòu)體的黃芩黃酮C-苷類化合物，并歸納了其ESI-MSn裂解特征與一般規(guī)律。黃晶晶等[7]采用HPLC-ESI-TOF-MS/MS方法，從澤蘭水提物中共鑒定到22個化合物，包括黃酮類、甾體類等。COLOMBO et al[8]利用LC-MS/MS方法從甘蔗提取物中鑒定到17種黃酮類成分，其中6-甲氧基藤黃菌素-8-C-阿拉伯糖-7-O-葡萄糖苷等7種為新化合物。BHATT et al[9]利用UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS/MS方法從竹葉花椒葉中分離鑒定到12種活性化合物，包括兒茶素、異牡荊素和橙皮苷等。然而，對于黃芩黃酮的整體化學組成與ESI裂解規(guī)律仍有待深入探索。

血清白蛋白負責體內(nèi)大量內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的運輸，具有重要生理功能[10]，其與天然藥物活性成分的結(jié)合是目前的研究熱點之一。牛血清白蛋白(BSA)因其與人血清白蛋白(HSA)的結(jié)構(gòu)同源性而被廣泛應(yīng)用。近年來，超濾質(zhì)譜技術(shù)被廣泛用于活性結(jié)合篩選[11]，該技術(shù)有效分離活性成分[12]，具有在線篩選能力強、速度快、操作簡單、可靠性高等特點[13-14]。

本文旨在對黃芩黃酮進行整體性分析，并篩選其中具有BSA蛋白結(jié)合活性的成分。首先通過分析目標成分的ESI-MS質(zhì)譜碎片裂解途徑，并結(jié)合精確分子量與紫外光譜吸收特征峰進行鑒定，再利用超濾質(zhì)譜技術(shù)篩選其中的BSA蛋白結(jié)合活性成分。本研究可為探索黃芩黃酮與功能性生物大分子的相互作用研究提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 原料、儀器及試藥

黃芩根(為炮制)購自寶雞醫(yī)藥大廈；牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma-Aldrich公司；漢黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黃芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和去甲漢黃芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷純度均在98%以上，購自寶雞辰光生物科技有限公司；正己烷(分析純)、氯仿(分析純)、正丁醇(分析純)和乙醇(分析純)均購自國藥集團化學試劑有限公司；AB TripleTOF 4600質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX)；Shimadzu LC-20ADXR液相色譜儀(日本島津)；Cence H1850臺式高速離心機(湖南湘儀)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國 Millipore)；Buchi Rotavapor R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；VORTEX-5恒溫混勻儀(浙江納德科學儀器有限公司)。

1.2 標準品溶液的配制

準確稱量標準品，用甲醇溶解，并稀釋至5 μg/mL，4 ℃ 保存，備用。

1.3 黃芩黃酮樣品的提取

稱取100 g黃芩，粉碎，過100目篩。原料依次用正己烷、氯仿和70%乙醇熱回流提取2～3 h，然后將70%乙醇提取液用正丁醇(水飽和后)萃取，取上層有機相，旋蒸濃縮至浸膏狀，將減壓濃縮后的提取物樣品用色譜甲醇復溶，濃度為10 μg/mL，過0.22 μm 濾膜，裝瓶，4 ℃保存，備用。

1.4 黃芩粗提物中BSA結(jié)合活性成分的篩選

參考相關(guān)文獻[15]，于1.5 mL離心管中分別加入190 μL乙酸銨緩沖液(10 mM，pH 6.86)和2 μL黃芩粗提物(乙酸銨緩沖液，50 mg/mL)，再分別加入8 μL BSA(乙酸銨緩沖液，100 μM)，37 ℃孵育30 min；將混合液加入2 mL超濾離心管(PES, 10 000 MW)中，10 000 g離心10 min，棄掉濾液；乙酸銨緩沖液(pH 6.86)洗滌3次；加入200 μL CH3OH-H2O(1∶1,v/v, pH 3.30)，10 000 g離心15 min，重復3次，收集濾液。另設(shè)置對照組，不加BSA，其他條件相同；濾液過0.22 μm膜，保存待分析。

1.5 LC-MS分析

色譜條件：色譜柱：Shim-pack XR-ODS (100 mm×2.0 mm, 2.2 μm)；流動相：A：水-0.1%甲酸、B：甲醇-0.1%甲酸；洗脫梯度：0 min，10%甲醇；8 min，48%甲醇；14 min，48%甲醇；20 min，100%甲醇；25 min，100%甲醇；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：280 nm。

質(zhì)譜條件：電離模式：ESI正離子模式；去簇電壓(DP)：100 V；噴霧電壓(IS)：5 500 V (+)、離子化溫度：550 ℃；霧化氣(GS1)：55 psi；輔助氣(GS2)：55 psi；氣簾氣(Curtain Gas)：30 psi；掃描范圍220～800m/z，全掃描模式；碰撞能量：MS110 eV,MS250 eV；數(shù)據(jù)采集及處理軟件使用Analyst 1.7和PeakView 2.0。

1.6 成分鑒定

使用UPLC-Q-TOF-MS分析標準品及樣品，歸納目標成分在ESI源下的質(zhì)譜碎片裂解規(guī)律；根據(jù)精確分子量誤差比對、質(zhì)譜碎片裂解路徑歸屬，并結(jié)合文獻報道的紫外光譜特征吸收峰，對目標成分進行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芩黃酮的LC-MS/MS分析

利用UPLC-TripleTOF-MS/MS分析了黃芩黃酮提取物，在5×10-6的質(zhì)量誤差范圍內(nèi)共鑒定出33種黃酮類成分，包括21種苷元和12種黃酮苷類成分，總離子流圖見圖1，主要色譜峰分離良好，具體的成分鑒定信息見表1。

表1 黃芩正丁醇萃取物中黃酮類成分的UPLC-TripleTOF MS/MS分析結(jié)果Tab. 1 Characterization of flavonoids from Radix Scutellariae n-butanol extracts by UPLC-TripleTOF-MS/MS

圖1 黃芩黃酮提取物的UPLC-TripleTOF MS檢測總離子流圖(TIC)Fig. 1 Total ions chromatogram (TIC) of the flavonoids extract from Radix Scutellariae by UPLC-TripleTOF MS

續(xù)表1

2.2 黃芩黃酮各成分的ESI裂解途徑規(guī)律

首先，通過與標準品的特征碎片離子比對，9個化合物得到確認，包括漢黃芩素、黃芩新素、漢黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、黃芩苷和黃芩素-6-O-β-葡萄糖醛酸苷。在此基礎(chǔ)上，通過分析ESI源下質(zhì)譜碎片裂解規(guī)律進一步推斷，并結(jié)合文獻報道進行確認。

化合物1-5均屬于僅有羥基取代的黃酮苷元類物質(zhì)?；衔?的準分子離子峰為m/z=255.065 2，與白楊素的[M+H]+精確分子量比對誤差為-0.8×10-6，推測其主要的二級碎片離子m/z=153.019 2和103.054 7主要來源于RDA 1/3斷裂產(chǎn)生的[1,3A+]和[1,3B+]離子，預(yù)示分子中A環(huán)有2個-OH取代基，而B環(huán)無取代基，與白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷標準品的苷元裂解一致。同時，HPLC檢測其最大紫外吸收波長為212，267和313 nm，與文獻報道一致[16]。因此，推測化合物1為白楊素，裂解路徑如圖2所示。同樣，化合物2-4被分別鑒定為2',5,6',7-四羥基黃酮、二氫黃芩素和2',3,5,6',7-五羥基黃酮。

圖2 白楊素的ESI-MS裂解路徑分析Fig. 2 Analysis of the primary fragmentation pathways of chrysin in ESI-MS

化合物6-21屬于甲氧基取代的黃酮苷元，失去1～n個CH3自由基是這類化合物的顯著特點。比如，化合物8在一級全掃描模式中顯示質(zhì)子化分子離子m/z=301.070 7，它失去一個CH3自由基后產(chǎn)生碎片離子m/z=286.045 6，該離子經(jīng)RDA反應(yīng)分別產(chǎn)生[1,3A+]m/z=168.005 0和[1,4A+]m/z=140.009 6，表明化合物A環(huán)含有2個-OH和1個-OCH3取代基；此外，準分子離子經(jīng)RDA 0/2斷裂也可以生成碎片[0,2B+]m/z=121.028 9，推測該化合物B環(huán)上有鄰位羥基取代。因此，化合物8被鑒定為5,8,2'-三羥基-7-甲氧基黃酮，裂解路徑如圖3所示。同時，其UVλmax為275和386 nm，符合黃酮類化合物的特征吸收[17]。

化合物11的 [M+H]+為m/z=285.075 8，其MS2譜圖中有碎片離子[M+H-30]+m/z=270.052 0，推測為丟失1個CH3自由基的結(jié)果，并且該離子再經(jīng)丟失中性分子H2O，CO2及CHO后生成m/z=252.042 0和m/z=179.046 2的碎片離子；其次，離子 [M+H-28]+m/z=241.049 4為失去一分子CO所得；此外，診斷性離子[1,3A+]m/z=168.004 8和[1,3B+]m/z=103.052 3預(yù)示該化合物A環(huán)上有2個-OH和1個-OCH3取代基，B環(huán)上無取代基，同時，碎片離子[1,3A+-CH3-OH]m/z=151.055 3的存在表明了OCH3取代在8位。因此，化合物11被推斷為漢黃芩素，裂解路徑見圖4。同時，其UVλmax為216和275 nm，符合黃酮類化合物的特征吸收。

圖4 漢黃芩素的ESI-MS裂解路徑分析Fig. 4 Analysis of the primary fragmentation pathways of wogonin in ESI-MS

圖3 5,8,2'-三羥基-7-甲氧基黃酮的ESI-MS裂解路徑分析Fig. 3 Analysis of the primary fragmentation pathways of 5,8,2'-trihydroxy-7-methoxyflavone in ESI-MS

圖5 5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的ESI-MS裂解路徑分析Fig. 5 Analysis of the primary fragmentation pathways of 5,6,7-trihydroxy-8-methoxyflavone-7-O-β-D-glucuronopyranoside in ESI-MS

圖6 5,7,2' -三羥基-6-甲氧基黃酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的ESI-MS主要碎片裂解路徑分析Fig. 6 Analysis of the primary fragmentation pathways of 5,7,2'-trihydroxy-6-methoxyflavone-7-O-β-D-glucuronopyranoside in ESI-MS

2.3 黃芩黃酮中的BSA結(jié)合活性成分

由于天然產(chǎn)物成分復雜，化合物之間存在相互作用，血清白蛋白是血液循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的蛋白質(zhì)，在多種外源性化合物的運輸和沉積中起著重要的作用。許多藥物吸收后會進入循環(huán)系統(tǒng)，并與血清白蛋白發(fā)生較強的和可逆的結(jié)合，影響藥物的生物活性和毒性，因此，藥物的吸收、分布、代謝和排泄特性以及它們的穩(wěn)定性和毒性可能會因為它們與血清白蛋白的結(jié)合而受到顯著影響，同時可能誘發(fā)血清白蛋白的構(gòu)象變化，從而影響藥物的活性。

使用超濾質(zhì)譜方法對黃芩黃酮提取物進行分析，結(jié)果表明，共有17個化合物與BSA存在一定的相互作用，通過分析化合物的保留時間、UV特征以及MS/MS數(shù)據(jù)并與黃芩化學成分的研究文獻對比，可進一步指認化合物的結(jié)構(gòu)，分別為：2',5,6',7-四羥基二氫黃酮醇、2',5,6',7-四羥基二氫黃酮、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖苷等(表1)。

3 結(jié)論

本研究從黃芩中鑒定出33種黃酮類成分，包括21種黃酮苷元與12種黃酮苷類，并對其在ESI-MS/MS下的質(zhì)譜裂解規(guī)律進行了歸納，其中白楊素-7-O-β-D-葡萄糖苷等17種成分顯示出BSA蛋白結(jié)合活性，是潛在的藥物先導化合物，該結(jié)果可為黃芩資源深入開發(fā)與中藥現(xiàn)代化提供理論依據(jù)。