基于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性的正交方法

陳中 盧星宇

（1. 中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣州 510275；2. 西湖大學(xué)分子科學(xué)公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái) 浙江省功能分子精準(zhǔn)合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310024）

蛋白質(zhì)是由氨基酸經(jīng)“脫水縮合”的方式組成的多肽經(jīng)過折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，是構(gòu)成生物體的三大基礎(chǔ)物質(zhì)之一，機(jī)體所有重要的組成部分都需要蛋白質(zhì)的參與。人體內(nèi)蛋白質(zhì)都是由20 種氨基酸按不同比例組合而成，但是性質(zhì)和生物功能各不相同，其原因與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準(zhǔn)確的方法是X-射線晶體衍射［1-6］，但對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、柔性的生物大分子蛋白質(zhì)來說，得到所需的晶體結(jié)構(gòu)較為困難。二維、多維核磁共振技術(shù)能測(cè)出溶液狀態(tài)下較小蛋白質(zhì)的構(gòu)象［3，7-9］，可是對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)的計(jì)算處理非常復(fù)雜。近十多年來，冷凍電鏡發(fā)展迅速，成為蛋白結(jié)構(gòu)解析的利器，在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了很多重大科學(xué)成果的突破［10-12］，然而其價(jià)格非常昂貴，機(jī)時(shí)緊張，需要非常專業(yè)的技術(shù)人員，尚不足以滿足大量課題組的需求。

通過測(cè)量蛋白質(zhì)的CD 譜，能夠分析和計(jì)算出蛋白質(zhì)大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，方法簡(jiǎn)單、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域［4-5，13-18］。如圖1 所示，圓二色光譜的遠(yuǎn)紫外波段，近紫外波段及可見波段分別可以研究蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及金屬蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)的相互作用。通常蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)在CD 譜的紫外區(qū)段（180-260 nm）有明顯的信號(hào)，主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長(zhǎng)范圍的CD 譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。如表1 所示，主要構(gòu)象包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、P2 結(jié)構(gòu)及無規(guī)卷曲。

蛋白質(zhì)在一定的物理和化學(xué)條件（加熱、加壓、脫水、振蕩、紫外線照射、超聲波、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基硫酸鈉）下，其空間構(gòu)象容易發(fā)生改變而失活，因此研究蛋白的構(gòu)象和構(gòu)型變化對(duì)其功能和應(yīng)用有重要的價(jià)值。蛋白質(zhì)的變性作用主要是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)被破壞。天然蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是通過氫鍵等次級(jí)鍵維持的，而變性后次級(jí)鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子就從原來有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序的松散的伸展?fàn)罱Y(jié)構(gòu)（但一級(jí)結(jié)構(gòu)并未改變）。熱變性是蛋白質(zhì)變性中最常見的一類現(xiàn)象，圓二色光譜的變溫檢測(cè)可以研究蛋白熱變性過程，并通過擬合直接獲取蛋白質(zhì)的熱變性中點(diǎn)溫度Tm 值和記錄整個(gè)熱變性過程，對(duì)研究蛋白組分的熱穩(wěn)定性及在外界環(huán)境改變時(shí)的變性過程具有重要的科學(xué)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)開發(fā)一種測(cè)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性的正交方法，以在180-260 nm 范圍內(nèi)的圓二色全光譜熱變性測(cè)試來考察蛋白質(zhì)構(gòu)象隨溫度的變化而改變的全過程。同之前的單波長(zhǎng)法相比，本方法的操作難度沒有增加，耗時(shí)和樣品量保持一致，避免了單波長(zhǎng)如何選點(diǎn)的問題，通過一次測(cè)量，既觀測(cè)了各個(gè)波長(zhǎng)的圓二色信號(hào)隨溫度變化的曲線，也觀測(cè)了圓二色光譜在程序升溫過程中的各個(gè)溫度點(diǎn)的變化，從而更全面地觀測(cè)蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)熱變性過程，這是單波長(zhǎng)法無法觀測(cè)到的信息。

圖1 圓二色光譜用于蛋白結(jié)構(gòu)的分析

表1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象的CD 譜分析

1 材料與方法

圓二色光譜儀采用英國(guó)應(yīng)用光物理公司Applied Photophysics Ltd 的Chirascan-V100。牛血清蛋白（CAS號(hào)：9048-46-8）和血紅蛋白（CAS 號(hào)：9008-02-0）來自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。配溶液用的純水來自屈臣士純凈水。圓二色光譜檢測(cè)用的比色皿的光程為0.5 mm。

2 結(jié)果

下面以牛血清蛋白（BSA）和血紅蛋白（HGB）為例，用全光譜正交法來分析蛋白樣品的熱變性過程。

2.1 蛋白熱變性實(shí)驗(yàn)的濃度優(yōu)化

為了選擇合適的蛋白濃度進(jìn)行熱變性實(shí)驗(yàn)，配置了從0.01-1 mg/mL 的5 種濃度的蛋白，分別測(cè)試它們的吸光度值和CD 值。

如圖2 所示，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?.1-0.5 mg/mL 時(shí)，吸光度值在0.4-2 左右，此區(qū)間是測(cè)試CD 譜的合適范圍，對(duì)應(yīng)的CD 譜曲線除強(qiáng)度不同，形狀完全一致。當(dāng)?shù)鞍诐舛鹊陀?.01 mg/mL，曲線已不能準(zhǔn)確看出蛋白結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍诐舛仍? mg/mL 的量級(jí)上，其吸光度在3.5 左右，吸光度值過高導(dǎo)致圓二色光譜不能準(zhǔn)確檢測(cè)，在CD 譜上可見180 nm 附近的曲線方向與其他3 個(gè)稍有不同。將有CD 信號(hào)的4 個(gè)濃度的蛋白進(jìn)行熱變性實(shí)驗(yàn)。同時(shí)監(jiān)控它們的吸光度和CD 譜曲線的變化。

圖2 BSA 蛋白的不同濃度的吸光度（A）和圓二色光譜（B）

通過圖3 的吸光度曲線分析，可以看出BSA蛋白的吸光度在0.1 mg/mL 和0.25 mg/mL 時(shí)隨著溫度的升高變化較小，在0.5 mg/mL 時(shí)變化較大，而1 mg/mL 時(shí)變化明顯。圖4 的CD 譜曲線表明當(dāng)?shù)鞍诐舛刃∮? mg/mL 時(shí)，蛋白的熱變性趨勢(shì)接近一致，而1 mg/mL 的蛋白由于吸光度較大，CD 譜曲線在高吸光度區(qū)域出現(xiàn)大幅度震蕩的噪音信號(hào)，顯示其不是適于進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)的合適濃度，所以測(cè)試蛋白的熱變性過程的濃度在0.1-0.5 mg/mL為宜。

2.2 蛋白熱變性構(gòu)象的軟件分析

當(dāng)測(cè)完一組蛋白的熱變性實(shí)驗(yàn)后，通過Global3熱力學(xué)分析軟件，如圖5 的每一個(gè)圖都有6 個(gè)窗口，從左上方到右下方可以得到以下信息：（1）每個(gè)波長(zhǎng)的圓二色變溫曲線；（2）特征溫度點(diǎn)的圓二色圖譜（如起始圖譜、變性中點(diǎn)溫度的圖譜）；（3）溫度-波長(zhǎng)CD 三維圖；（4）計(jì)算出的濃度分布作為溫度的函數(shù)；（5）噪音三維圖；（6）計(jì)算出的熱力學(xué)參數(shù)（Tm 值和構(gòu)象的焓變）。前5 個(gè)窗口根據(jù)每個(gè)波長(zhǎng)的變溫曲線，逐步計(jì)算出此蛋白的Tm值，同時(shí)也證實(shí)此分析結(jié)果的可靠性發(fā)現(xiàn)，3 種適合濃度BSA 的Tm 值都在65.5℃；所以只要吸光度在合理的區(qū)間（0.2 ＜ A ＜ 3），Tm 值不受濃度的影響。

圖4 BSA 蛋白4 種濃度熱變性的CD 譜

圖5 Global3 軟件分析BSA 蛋白3 種濃度熱變性結(jié)果

除了熱變性分析軟件，使用CDNN 軟件做蛋白構(gòu)象的擬合分析，從蛋白熱變性過程的圓二色譜中的選取3 個(gè)溫度的波長(zhǎng)曲線：起始溫度點(diǎn)（20℃），中間溫度點(diǎn)（56℃）和最終溫度點(diǎn)（96℃），用軟件計(jì)算其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖6 的結(jié)果可以看到，BSA 蛋白最初的狀態(tài)是螺旋態(tài)為主，隨著溫度的逐漸升高，CD 譜的強(qiáng)度下降，螺旋結(jié)構(gòu)向轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲逐漸變化，具體表現(xiàn)為構(gòu)象從α 螺旋向β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，說明隨著溫度的上升，蛋白構(gòu)象的總體變化是一個(gè)從有序到無序的過程，最終無規(guī)卷曲所占的比例最大。

圖6 BSA 蛋白構(gòu)象CDNN 軟件分析結(jié)果

2.3 其他蛋白的熱變性測(cè)試分析

除了BSA 蛋白外，還用血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）進(jìn)行熱變性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)上述測(cè)試結(jié)果，血紅蛋白的濃度選用0.25 mg/mL 進(jìn)行測(cè)試。

測(cè)試結(jié)果如圖7 所示，相比于BSA 血清蛋白，血紅蛋白的熱變性過程更加明顯，當(dāng)溫度在96℃時(shí)，蛋白的CD 信號(hào)非常微弱，劇烈的熱變性過程表明此蛋白對(duì)于溫度變化更加敏感。從圖8 的Global 3軟件可以分析出此血紅蛋白的Tm 值55.9℃，略低于前面的血清蛋白，也說明血紅蛋白的熱穩(wěn)定性相對(duì)血清蛋白較低。圖9 的CDNN 的分析結(jié)果與血清蛋白類似，隨著溫度上升，同樣是發(fā)生從α 螺旋向β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的構(gòu)象轉(zhuǎn)化。

2.4 單波長(zhǎng)測(cè)試對(duì)比

作為對(duì)比，采用單波長(zhǎng)法重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)。以BSA（0.25 mg/mL）為例，進(jìn)行一組蛋白熱變性單波長(zhǎng)法的測(cè)試。如圖10 和表2 所示，根據(jù)全譜曲線選出3 個(gè)極值點(diǎn)（191 nm、208 nm、222 nm），一個(gè)隨機(jī)點(diǎn)（235 nm），一個(gè)端點(diǎn)（260 nm）和一個(gè)特殊的交叉點(diǎn)（203 nm），分別做6 個(gè)單波長(zhǎng)蛋白熱變性曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)擬合圖10 所示，在所有的極值點(diǎn)的Tm值都在65-66℃，中間隨機(jī)點(diǎn)也在65-66℃，端點(diǎn)有兩個(gè)值分別在的在54℃和80℃附近，特殊交叉點(diǎn)在52℃左右。所以單波長(zhǎng)測(cè)試與選取的波長(zhǎng)位置有很大關(guān)系，選取的3 個(gè)極值點(diǎn)的結(jié)果都是一致的，與全譜所測(cè)的Tm 值基本一致，因?yàn)闃O值點(diǎn)反應(yīng)的是蛋白構(gòu)象對(duì)溫度最敏感的部分，中間任意點(diǎn)只要有足夠的變化，也能正確反應(yīng)熱變性的過程，只有變化特別小的特殊點(diǎn)和幾乎不變化的端點(diǎn)會(huì)給出錯(cuò)誤信息（擬合的曲線方程不相同），所以采用單波長(zhǎng)測(cè)試時(shí)宜選擇變化大的點(diǎn)更能反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的真實(shí)信息。

圖7 血紅蛋白熱變性測(cè)試結(jié)果

圖8 Global3 軟件分析HGB 蛋白熱變性的結(jié)果

3 討論

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性探索是研究蛋白功能及開發(fā)新藥物的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。相比于復(fù)雜昂貴的核磁、XRD 及冷凍電鏡，圓二色光譜是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的手段，在研究蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象領(lǐng)域非常必要，不同于傳統(tǒng)的單波長(zhǎng)法，熱變性過程中只求得蛋白的Tm 值信息，效率非常低下。本研究成功構(gòu)建了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的正交方法，追蹤各個(gè)溫度下的蛋白結(jié)構(gòu)變化過程，覆蓋了蛋白熱變性過程中的非常全面的信息。

本實(shí)驗(yàn)首先通過4 組濃度梯度的測(cè)試，優(yōu)化出蛋白的熱變性過程的適宜濃度為0.1 mg-0.5 mg。從蛋白的熱變性全譜中，選取了BSA 蛋白變溫過程中的3 組曲線，發(fā)現(xiàn)蛋白的構(gòu)象從α 螺旋向β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，說明隨著溫度的上升，蛋白構(gòu)象的總體變化是一個(gè)從有序到無序的過程，最終無規(guī)卷曲所占的比例最大。用HGB 進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分證明了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可靠性。這些分析結(jié)果是用熱變性單波長(zhǎng)法無法實(shí)現(xiàn)的。此外，這種全譜測(cè)試方法，在藥物開發(fā)如生物類似藥Biosimilar 的開發(fā)過程中，可以同步觀測(cè)生物類似藥與參比藥物的結(jié)構(gòu)變化過程的一致性，非常適合于藥物篩選。

為了驗(yàn)證本方法所測(cè)試Tm 值的可靠性，將相同的BSA 蛋白用單波長(zhǎng)法分別進(jìn)行蛋白熱變性的6組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)波長(zhǎng)取在極值點(diǎn)和變化大的點(diǎn)所測(cè)試的Tm 值結(jié)果和全譜法完全一致，而波長(zhǎng)取在變化小的端點(diǎn)和交叉點(diǎn)與本研究結(jié)果差別較大，而且擬合曲線也不正常。所以相比于單波長(zhǎng)，本方法既不需要對(duì)波長(zhǎng)的選取有任何顧慮，又綜合了熱變性過程中所有的結(jié)構(gòu)變化的信息，所得的分析結(jié)果也是最全面，最準(zhǔn)確的。

圖9 HbC 蛋白構(gòu)象CDNN 軟件分析結(jié)果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于蛋白的熱穩(wěn)定性測(cè)試開發(fā)了一種全光譜的正交方法，通過與單波長(zhǎng)法的對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸光度在合理的范圍內(nèi)，兩種方法都能正確地測(cè)試出蛋白的熱變性溫度（Tm 值），且Tm 值不受濃度的影響。全光譜法測(cè)試所花的時(shí)間和單波長(zhǎng)法測(cè)試的時(shí)間是一樣的，單波長(zhǎng)測(cè)試觀測(cè)某一特定波長(zhǎng)的變化，所得的信息有限；而全光譜法能反應(yīng)蛋白在所有波長(zhǎng)段的熱穩(wěn)定性狀況，所得的結(jié)構(gòu)信息更完整，包括各種螺旋、折疊結(jié)構(gòu)等隨溫度的變化情況，有利于了解蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的整體熱變性過程，將對(duì)蛋白藥物的穩(wěn)定性監(jiān)控和藥物篩選提供更全面信息。

圖10 六個(gè)代表性點(diǎn)的熱變性過程的溫度-CD 強(qiáng)度圖

表2 六個(gè)代表性點(diǎn)的熱變性過程的溫度-CD 強(qiáng)度的擬合方程和擬合結(jié)果