尹 國，路正營，孫 璐，張彥波，李世云

（邯鄲市農(nóng)業(yè)科學院，河北邯鄲056001）

0 引言

陸地棉，屬錦葵科、棉屬一年生草本植物，是一種國家重要戰(zhàn)略物資。棉鈴蟲曾在中國各大棉區(qū)大面積發(fā)生，轉Bt抗蟲棉的種植，已基本控制了棉鈴蟲的發(fā)生。然而，蚜蟲和紅蜘蛛等次生害蟲逐漸成為危害棉花生長的主要害蟲，嚴重影響棉花產(chǎn)量和品質[1]。目前生產(chǎn)上主要依靠農(nóng)藥控制蚜蟲和紅蜘蛛，一方面增加了植棉成本，另一方面容易造成環(huán)境污染。因此，培育抗蚜蟲和紅蜘蛛的棉花新品種，利用作物自身的抗性防治蚜蟲和紅蜘蛛成為育種家急需攻克的一個難題。

金花葵(Abelmoschus manihot)，又名菜芙蓉、野芙蓉，是屬錦葵科、秋葵屬的一年生草本植物，和棉花一樣具有無限開花結果習性。其對蚜蟲和紅蜘蛛具有一定程度上天然的抗性，可在葉柄和葉背面分泌一種鹽晶狀顆粒物，但其對棉鈴蟲不具有抗性。二者同屬錦葵科作物，親緣關系較近，具有相似的花器官和結構。相較于陸地棉，金花葵的果實較為早熟。前人從不同方面，例如遠緣雜交的方法、幼胚拯救、雜交種農(nóng)藝性狀變異、果實成分變化、雜交種純度和真實性等方面對遠緣雜交進行了深入的研究，獲得了大量數(shù)據(jù)，利用遠緣雜交創(chuàng)制新的種質資源并獲得成功的案例已有大量報道，徐鳳等[2]研究了22常綠杜鵑遠緣雜交種子萌發(fā)特性，證實雖然杜鵑花屬種間雜交可以獲得種子，但是很多組合產(chǎn)生的種子不具有活力。鄭本川等[3]的研究結果顯示遠緣雜交后代單株產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀與親本存在較大差異。劉國彬等[4]板栗和錐栗之間可以進行遠緣雜交，并獲得了結實率較高的組合。楊利平等[5]對百合科作物進行了遠緣雜交并對雜交種的純度進行了鑒定。王學芳等[6]利用甘藍型油菜與白菜，通過種間雜交創(chuàng)造出了早熟油菜新種質。但是，目前關于金花葵的研究成果相對較少，其染色體倍性和條數(shù)以及以金花葵和陸地棉為親本的遠緣雜交未見相關報道，對其遺傳特性和親和力知之甚少。因此，本研究利用遠緣雜交技術將金花葵gDNA導入陸地棉，希望在其后代中找到有價值的符合育種目標性狀的種質資源，這一研究也是培育抗蚜蟲和紅蜘蛛的早熟陸地棉新品種的有益嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料‘金花葵3號’和陸地棉種子‘邯818’，均為邯鄲市農(nóng)業(yè)科學院自育品種。如圖1所示兩種植物主要不同器官之間的差異。

圖1 ‘金花葵3號’和‘邯818’主要器官差異

1.2 方法

1.2.1 ‘金花葵3號’根尖染色體壓片鏡檢 利用沙培法培養(yǎng)‘金花葵3號’，當根尖長至1～1.5 cm時剪取根尖進行試驗，采用任文娟[7]、李心[8]、丁海燕[9]和李曉玲等[10]提供的方法壓片鏡檢，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉及4℃低溫處理根尖[11]，預處理5 h。卡諾固定液固定24 h并利用蒸餾水充分清洗后，用1 mol/L HCl 60℃解離6～10 min，改良的卡寶品紅染液染色，壓片鏡檢[12]。挑選染色體形態(tài)完整、分散性較好的中期壓片拍照[13]。

1.2.2 遠緣雜交

（1）培育幼苗，用500 mg/L濃度的縮節(jié)胺溶液分別處理金‘花葵3號’和‘邯818’各18 h。采用常規(guī)沙培法培育幼苗，‘邯818’于4月18日播種，‘金花葵3號’于4月30日播種，二者錯期播種育苗，以利于二者于7月中上旬實現(xiàn)花期相遇。設置溫度為30℃，光照和黑暗環(huán)境培養(yǎng)各12 h，直至幼苗長出。

（2）幼苗長出后，待幼苗長至3 cm高時，噴灑300 mg/L濃度的縮節(jié)胺2～3次，對幼苗進行化控，防止出現(xiàn)高腳苗，促進幼苗主莖變粗壯，為接下來二者的嫁接做好準備。

（3）待二者的主莖達到2.5～3.0 mm時，以陸地棉幼苗為砧木，以金花葵幼苗為接穗將二者進行嫁接，促進兩種作物營養(yǎng)物質和遺傳物質的交流，提高二者開花期做雜交時的親和性。同時，留下部分‘金花葵3號’和‘邯818’幼苗自然生長。

（4）待嫁接苗完全成活后，轉移至室內靠近窗戶的地方，在通風弱光的環(huán)境中進行煉苗，3～5天后待嫁接苗足夠強壯時，將嫁接苗一分為二，移栽至編號為Z和z的兩個防蟲網(wǎng)大棚中；同樣，將‘邯818’一分為二，移栽至編號為M和m的兩個防蟲網(wǎng)大棚中，‘金花葵3號’幼苗移栽至編號為J的防蟲網(wǎng)大棚中，防止開花期做雜交時蜜蜂和昆蟲傳粉，形成假雜交鈴。

（5）待嫁接苗和‘邯818’均開花時，于每天下午17:00—19:00時之間，將當天Z和M棚中的嫁接苗和‘邯818’的花蕾全部剝開去雄，記錄去雄數(shù)量。用手將花冠從基部撕下，保留花萼，用刀片將花絲和花藥全部從花柱上自上而下輕輕刮下，不要損傷花柱和柱頭。將吊牌懸掛于去雄花蕾花柄的基部并記錄去雄日期。仔細檢查每一棵嫁接苗，確保無遺漏花蕾（如圖2所示）。

圖2 ‘金花葵3號’去雄后的花蕾

（6）于第二天上午10時左右，待z、m棚的嫁接苗和‘邯818’花粉散開后，取下花朵，撕下花冠和花萼，分別將z棚中嫁接苗的花粉均勻涂抹M棚中‘邯818’已去雄的柱頭上；同理，將m棚中邯818的花粉均勻涂抹Z棚中嫁接苗已去雄的柱頭上，然后將配制的用于提高遠緣雜交結實率的營養(yǎng)液（見表1）用微型注射器在雌蕊的基部各注射3個點，每個點5～8 μL，同時設置對照。將嫁接苗和‘邯818’的花冠用剪刀剪成2 cm×2 cm大小的方塊，分別將‘邯818’和嫁接苗的花粉均勻涂抹于方塊上，最后用此方塊將嫁接苗和‘邯818’的柱頭包裹，用紅繩連同柱頭、涂抹方塊和花萼一起捆扎（如圖3所示），避免離體花粉直接暴露在太陽紫外線中而過早失去活力。連續(xù)去雄和授粉10～15天，確保去雄和授粉雜交鈴數(shù)量在200個以上。

表1 提高遠緣雜交結實率營養(yǎng)液成分含量表(1 L)

圖3 遠緣雜交授粉后苞葉柱頭捆扎方法

（7）每日記錄雜交鈴的生長發(fā)育情況，包括正常發(fā)育和脫落雜交鈴的數(shù)量等相關信息。

1.2.3 種子收集 約35天后，待嫁接苗雜交鈴由綠色變?yōu)楹谏磳⒄亚?，將每個雜交鈴連同吊牌一起單獨裝入一個網(wǎng)沙袋中，放置太陽光下晾曬直至雜交鈴自然開裂，將外殼去除，收集雜交鈴種子待用。

1.2.4 發(fā)芽率檢測將嫁接苗上得到的雜交種，‘金花葵3號’和‘邯818’種子各50粒，單粒播種在育苗盤中，放置光照培養(yǎng)箱中，設置溫度為30℃，光照和黑暗環(huán)境各12 h，記錄雜交種子出苗日期和發(fā)芽率。

1.2.5 雜交種真實性SSR擴增檢測 待雜交種、‘金花葵3號’和‘邯818’長出真葉后，利用宋國立等[14]、葉磊等[15]、和王沛政等[16]提供的DNA提取方法，同時提取‘金花葵3號’、‘邯818’以及雜交種的嫩葉的gDNA，利用SSR分子標記技術[17-19]篩選出‘金花葵3號’和‘邯818’特異性引物J-3和H818，引物序列見表2。

表2 引物名稱及序列

1.2.6 雜交種根尖染色體壓片鏡檢 方法同1.2.4。

2 結果與分析

2.1 ‘金花葵3號’及雜交種根尖染色體壓片鏡檢

通過‘金花葵3號’根尖鏡檢結果得知，‘金花葵3號’含有66條染色體，核型公式為K(2n)=2x=66，由此可知‘金花葵3號’為二倍體植物，其花粉和母細胞應含有33條染色體?！?18’為含有52條染色體的異源四倍體陸地棉品種，其花粉含有26條染色體。因此二者的雜交種F1（‘金花葵3號’為母本）應為含有59條染色體的異源三倍體，根尖鏡檢結果進一步證實了該結論（圖4）。由于該雜交種為異源三倍體，因此無法完成有絲分裂，雜交種F1發(fā)芽試驗完成后繼續(xù)培養(yǎng)幼苗，花粉全部敗育，并未得到F2。

圖4 ‘金花葵3號’和雜交種F1根尖染色體鏡檢結果

2.2 不同授粉處理方法成鈴率比較

由表3可知，以陸地棉‘邯818’為母本的雜交組合，無論是直接雜交還是注射營養(yǎng)液，均未得到正常發(fā)育的雜交鈴，幼鈴一般在授粉后2～5天即脫落。而以‘金花葵3號’為母本的雜交組合，直接授粉雜交后的207個雜交鈴，雖然得到了7個正常發(fā)育的雜交鈴，但是雜交鈴內部并未得到正常發(fā)育的雜交種F1（如圖5所示），而授粉后注射營養(yǎng)液的210個雜交鈴，得到了32個雜交鈴，成鈴率提高了11.8%，且雜交鈴內部得到了與自然授粉一樣正常發(fā)育的雜交種F1（如圖6、圖7所示），且發(fā)芽率與‘金花葵3號’和‘邯818’無顯著性差異（如表4所示）。

表3 不同雜交方法對試驗結果的影響

表4 不同作物發(fā)芽率統(tǒng)計

圖5 ‘金花葵3號’、‘邯818’和雜交種F1gDNA特異性引物PCR檢測結果

圖6 嫁接苗雜交后正常發(fā)育但敗育的的金花葵鈴

圖7 嫁接苗雜交注射營養(yǎng)液后發(fā)育成的金花葵鈴

2.3 雜交種F1真實性SSR擴增檢測

利用‘金花葵3號’和‘邯818’特異性引物分別PCR擴增雙方gDNA，分別得到了一條約900 bp和1300 bp清晰的特異性條帶；雙重PCR擴增雜交種F1的gDNA，得到了包含900 bp和1300 bp的兩條特異性條帶（如圖5所示），與2.1鏡檢結果相互印證，證實雜交種F1為陽性，為真實雜交種。

3 討論與結論

目前，各種作物利用常規(guī)雜交選育技術選育新品種仍然是主要方法，但也遇到了諸如親本遺傳資源狹窄以及難于選育突破性品種的局面。雖然遠緣雜交在一定程度上可以獲得成功，但是其后代還無法按照育種家設想的方向整合雙親優(yōu)良性狀并穩(wěn)定遺傳，這需要我們進一步探索其內在規(guī)律。本研究以‘金花葵3號’和‘邯818’為親本進行遠緣雜交，同時獲得了‘金花葵3號’以及雜交種的染色體倍性和數(shù)量，首次證實‘金花葵3號’為基因組含有66條染色體的二倍體植物，為今后繼續(xù)研究遠緣雜交提供了理論和物質基礎。以異源四倍體陸地棉‘邯818’為母本，和‘金花葵3號’無論是直接雜交還是注射營養(yǎng)液均無法得到正常發(fā)育的雜交鈴。這一研究結果和許鳳等[2]的研究結果相似。以‘金花葵3號’為母本，雖然直接雜交可以獲得雜交鈴，但是雜交鈴未見正常發(fā)育的雜交種F1籽粒，而注射營養(yǎng)液后卻得到了正常發(fā)育的雜交種F1籽粒，且F1可以正常生長，但是無法結實。由此可見，營養(yǎng)液在雜交后幼胚發(fā)育初期有助于幼胚的發(fā)育。因此，在遠緣雜交研究中，親本的合理選擇對試驗結果的影響很大，這一現(xiàn)象是否與雙親染色體數(shù)目有關，值得進一步研究。我們大膽推測，以染色體數(shù)量較多的親本為母本，在授粉后外施營養(yǎng)液，會有助于提高雜交成功率和結實率。下一步，將通過染色體加倍技術使雜交種F1染色體獲得加倍，以期得到花粉可育、性狀穩(wěn)定遺傳的新種質。

圖8 自然生長金花葵自花授粉后發(fā)育成的金花葵成鈴