金龍飛，尹欣幸，馮美利，周麗霞，曹紅星

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶油料科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南文昌571737）

0 引言

硼是植物生長(zhǎng)和發(fā)育必需的微量元素之一。硼在植物中的直接功能是參與植物細(xì)胞壁建成，橋接細(xì)胞壁和細(xì)胞膜；間接功能有參與糖類的運(yùn)輸、核酸的合成、生長(zhǎng)素代謝、花粉管的發(fā)育、細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)以及光合作用等[1-3]。缺硼會(huì)導(dǎo)致植物出現(xiàn)新葉枯死，老葉扭曲、變脆，葉脈木栓化破裂，花而不實(shí)，果實(shí)流膠等癥狀[4-5]，增施硼肥能夠有效提高玉米、甜菜和油菜的產(chǎn)量[6-8]。植物根系吸收硼的方式主要有三種，一是通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散直接穿過(guò)磷脂雙分子層進(jìn)入根部，這是植物吸收硼的最主要的方式；二是利用水通道蛋白（major intrinsic protein,MIP）對(duì)硼進(jìn)行易化擴(kuò)散運(yùn)輸；三是消耗能量通過(guò)硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（boron transport,BOR）對(duì)硼進(jìn)行高親和力的主動(dòng)運(yùn)輸[9]。Takano等[10]首先在擬南芥中分離出編碼轉(zhuǎn)運(yùn)硼酸的水通道蛋白基因AtNIP5;1，缺硼脅迫下該基因在根尖伸長(zhǎng)區(qū)和根毛中的表達(dá)量劇烈上調(diào)；在非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)AtNIP5;1具有協(xié)助硼酸向胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)墓δ埽勘磉_(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植株在低硼環(huán)境下的硼吸收能力。隨后在水稻[11]、柑橘[12]、油菜[13]、獼猴桃[14]等作物中都相繼對(duì)NIP5進(jìn)行分離和功能鑒定，這些研究表明NIP5作為硼通道蛋白在植物缺硼脅迫中對(duì)硼吸收起著重要的作用。Feng等[15]在油菜中鑒定了調(diào)控硼轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，WRKY47通過(guò)上調(diào)BnaA3.NIP5;1的表達(dá)，提高油菜對(duì)硼的吸收能力，增強(qiáng)對(duì)低硼的耐受性。油棕是世界上最高產(chǎn)的油料作物，棕櫚油平均產(chǎn)量為5000～7000 kg/hm2，是花生的 5～6 倍 、大豆的 9～10倍[16]。油棕周年開花結(jié)果，生長(zhǎng)量大，一株油棕每年積累的干物質(zhì)重量高達(dá)240 kg，因此油棕每年從土壤中帶走大量養(yǎng)分，除了氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫等大量元素外，還有鐵、錳、鋅、銅、硼、鉬、氯等微量元素[17]。硼在油棕的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，缺硼會(huì)導(dǎo)致油棕小葉畸形扭曲，葉尖處倒鉤，果實(shí)中的種仁發(fā)育受阻形成空殼，進(jìn)而導(dǎo)致油棕產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[17]。油棕主要分布在熱帶地區(qū)包括非洲的中西部，南美洲的中北部，亞洲的東南部，這些地區(qū)土壤硼含量較低，而且熱帶地區(qū)降雨量大易導(dǎo)致土壤硼的流失[18]。硼是油棕生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的微量元素，但與油棕硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的的分子機(jī)制研究還少見報(bào)道，隨著油棕基因組的公布[19]，克隆編碼油棕硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因并分析其生物學(xué)功能成為可能。本研究從油棕厚殼種中克隆了EgNIP5;1基因，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、序列特征、進(jìn)化關(guān)系和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)采用熒光定量分析其在油棕缺硼脅迫下的表達(dá)模式，為后續(xù)油棕硼吸收規(guī)律研究及硼高效油棕品種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及缺硼處理

實(shí)驗(yàn)材料為厚殼種油棕(Elaeis guineensis)，種子采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所基地(19°33'N，110°47'E)。將油棕種子置于39℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，待種子萌芽后，置于蛭石中育苗。幼苗長(zhǎng)至4片真葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲害的幼苗采用水培的方式進(jìn)行培養(yǎng)。幼苗先用自來(lái)水進(jìn)行1周的適應(yīng)性培養(yǎng)，然后依次更換為1/4，1/2和全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。待幼苗適應(yīng)水培環(huán)境后（有新根長(zhǎng)出）進(jìn)行缺硼處理。缺硼處理以硼缺乏(0.001 mg/L)的Hoagland和Aron營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照為正常的營(yíng)養(yǎng)（硼含量0.25 mg/L）。水培設(shè)置通氣裝置，每1 h通氣15 min，每5天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。每盆4株幼苗為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在缺硼處理0、24、48、72 h和恢復(fù)足量硼供應(yīng)后48 h，分別采集處理和對(duì)照的根尖樣品液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)于2019年4月—2019年5月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所進(jìn)行。

1.2 基因挖掘及生物信息學(xué)分析

從NCBI中下載擬南芥AtNIP5;1(AT4G10380)基因的氨基酸序列，在油棕基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中采用BLSATP進(jìn)行比對(duì)分析獲得與AtNIP5;1高度同源序列，下載其氨基酸，mRNA以及gDNA序列。采用ORF finder在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析開放閱讀框，采用Primer-BLAST在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用Gene Structure Display Server 2.0在線工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，采用Sequence Manipulation Suite在線工具(https://www.bioinformatics.org/sms2/index.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，采用GeneDoc軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)分析，采用MEGA6軟件進(jìn)行進(jìn)化分析。

1.3 硼含量的測(cè)定

油棕根尖硼含量采用姜黃素比色法測(cè)定[20]。具體方法如下：稱取0.5 g干樣，加1 mol/L的稀鹽酸20 mL提取24 h，吸取1.0 mL提取液于30 mL的陶瓷蒸發(fā)皿中，加2 mL姜黃素-草酸溶液（0.05 g姜黃素與5.0 g草酸溶于100 mL 95%的乙醇中），置于70℃水浴蒸干，立即轉(zhuǎn)移至70℃烘箱烘干0.5 h，取出后立即放入干燥器中，逐一取出加入20 mL 95%的乙醇溶解，同時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以相應(yīng)試劑空白作為參比，測(cè)定550 nm處的吸光度。

1.4 核酸提取及基因表達(dá)分析

總RNA采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（上海生工）進(jìn)行提取，cDNA采用（南京諾唯贊）HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行合成，具體步驟參照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。熒光定量PCR采 用 SYBR? Select Master Mix(Life Technologies)進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系參照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，引物序列（表1）。

表1 基因全長(zhǎng)克隆及熒光定量PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Ducan檢測(cè)法進(jìn)行硼含量和基因表達(dá)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EgNIP5;1的克隆及生物信息學(xué)分析

以油棕根尖cDNA為模板，以NIP5;1F和NIP5;1R為引物進(jìn)行基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增，獲得一條單一條帶，長(zhǎng)度在1 kb和2 kb之間（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示條帶堿基長(zhǎng)度為1182 bp，其中ORF長(zhǎng)度為894 bp，編碼297個(gè)氨基酸。對(duì)其基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子（圖2）。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)EgNIP5;1的氨基酸分子量為30.74 kDa，等電點(diǎn)為8.81。對(duì)EgNIP5;1的蛋白保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，EgNIP5;1蛋白具有2個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)NPS(Asn-Pro-Ser)NPV(Asn-Pro-Val)位點(diǎn)（圖3）。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)EgNIP5;1與AtNIP5;1，CiNIP5和TcNIP5聚在一個(gè)進(jìn)化支上，序列相似度分別為70%，71%和77%（圖4）。對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)EgNIP5含有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（圖5）。

圖1 EgNIP5;1基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增

圖2 EgNIP5;1基因結(jié)構(gòu)

圖3 擬南芥、水稻、柑橘、可可和油棕的NIP氨基酸序列

圖4 EgNIP5;1的進(jìn)化關(guān)系

圖5 EgNIP5;1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2 缺硼脅迫下油棕根尖硼含量及EgNIP5;1的基因表達(dá)

對(duì)缺硼脅迫下油棕根尖的硼含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，硼含量隨缺硼脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，在缺硼48 h和72 h的根尖硼含量為13.28 mg/kg和12.14 mg/kg，顯著低于對(duì)照(17.59 mg/kg)；恢復(fù)供硼48 h根尖的硼含量恢復(fù)至16.27 mg/kg，略低于對(duì)照（圖6）。利用熒光定量PCR對(duì)EgNIP5;1在油棕不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)EgNIP5;1在根中的表達(dá)量顯著高于莖和葉（圖7A）。對(duì)缺硼脅迫下EgNIP5;1在根尖中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)缺硼處理后EgNIP5;1的表達(dá)量逐漸增高，在缺硼脅迫后48 h達(dá)到最高值是對(duì)照的8.2倍?；謴?fù)供硼48 h后EgNIP5;1表達(dá)量迅速降低，其表達(dá)量與缺硼0 h無(wú)顯著差異（圖7B）。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)油棕根尖硼含量

圖7 EgNIP5;1的基因表達(dá)

3 討論與結(jié)論

NIPs(nodulin 26-like intrinsic proteins)家族屬于水通道蛋白MIP(Membrane intrinsic proteins)家族的亞家族之一，能運(yùn)輸硼酸和尿素等小分子物質(zhì)，例如擬南芥AtNIP4;1、AtNIP5;1、AtNIP6;1和AtNIP7;1[10,21-23]，水稻的OsNIP3;1（與AtNIP5;1同源）能夠運(yùn)輸硼酸[11]，西葫蘆的CpNIP1能夠運(yùn)輸尿素[24]。nip5突變體在足量硼條件下的表型與野生型無(wú)差異，但在低硼條件下植物生長(zhǎng)受到明顯抑制[10]；在煙草中超量表達(dá)CiNIP5能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株在低硼條件的硼吸收能力，其植株生物量顯著高于野生型[25]，表明NIP5主要在低硼條件將環(huán)境中的硼轉(zhuǎn)運(yùn)至植物體內(nèi)。本研究采用同源克隆的方式獲得油棕EgNIP5;1的基因全長(zhǎng)，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)EgNIP5;1具有與擬南芥、水稻、柑橘、可可等植物相同的NPS、NPV和Ar/R位點(diǎn)。油棕與擬南芥、水稻、柑橘、可可等物種的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)EgNIP5;1與可可TcNIP5進(jìn)化關(guān)系最近，表明二者具有相似的功能?？缒そY(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白具有5個(gè)跨膜區(qū)，這與在擬南芥[10]、煙草[26]和柑橘[25]上的研究結(jié)果一致。因此推測(cè)克隆的序列為編碼硼酸通道蛋白的基因。

NIP5;1在柑橘[25]和獼猴桃[14]根中的表達(dá)量顯著高于莖和葉；在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)正常硼條件下OsNIP3;1在根和莖中的表達(dá)量無(wú)差異，而在缺硼脅迫下根中的表達(dá)量迅速上調(diào)，且表達(dá)量顯著高于莖[11]，這表明NIP5;1是植物根中吸收硼的主要通道蛋白。本研究中油棕的EgNIP5;1在根中的表達(dá)量顯著高于葉和莖，表明其主要參與根尖對(duì)硼的吸收，這與柑橘和獼猴桃中研究結(jié)果一致。NIP5;1的表達(dá)對(duì)缺硼反應(yīng)迅速，在擬南芥中缺硼3 h時(shí)AtNIP5;1的表達(dá)量就顯著高于對(duì)照，在缺硼24 h達(dá)到峰值隨后表達(dá)量略微降低；在恢復(fù)供硼后，其表達(dá)量也恢復(fù)至對(duì)照水平[10]。在本研究中，油棕根尖的硼含量隨著缺硼時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低；EgNIP5;1的表達(dá)量也迅速上升，在缺硼48 h達(dá)到峰值；恢復(fù)供硼后，根尖的硼含量升高，EgNIP5;1的表達(dá)量迅速降低。這表明EgNIP5;1的表達(dá)受到外界硼含量的調(diào)控，在缺硼環(huán)境下通過(guò)上調(diào)表達(dá)增強(qiáng)對(duì)硼的吸收能力，當(dāng)硼含量恢復(fù)至正常水平時(shí)，EgNIP5;1的表達(dá)量恢復(fù)至正常水平。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)分析推測(cè)EgNIP5;1具有硼轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，后續(xù)還需要采用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)明確其生物學(xué)功能，同時(shí)鑒定控制EgNIP5;1的轉(zhuǎn)錄因子，明確其調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而為后續(xù)篩選油棕硼高效品種奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究首次在油棕中克隆到編碼硼轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白的基因EgNIP5;1，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其具有NIP5基因的特征，基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其主要在根中表達(dá)，在缺硼條件下上調(diào)表達(dá)，恢復(fù)供硼后表達(dá)量降低，初步推測(cè)其具有硼轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。