李駿飛 鄭小蓉 姜建偉 章紅燕

中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）? 中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與腫瘤研究所，浙江杭州? ?310022

[摘要] 目的 研究芍藥軟肝方（SRF）調(diào)控Bax/Bcl-2-Caspase-3通路抑制肝癌生長(zhǎng)的作用及機(jī)制。 方法 建立HepG2荷瘤裸鼠模型，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、高、中、低濃度芍藥軟肝方（SRF）組，灌胃3周后稱取瘤重，TUNEL法觀察腫瘤細(xì)胞凋亡情況，Western-blot法檢測(cè)對(duì)組織中NF-κB-p65、VEGF、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果 （1）不同濃度芍藥軟肝方（SRF）均可抑制HepG2荷瘤裸鼠體內(nèi)肝癌腫瘤的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;（2）SRF可降低裸鼠肝癌組織中NF-κB-p65、VEGF、Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。上述作用均呈濃度依賴。 結(jié)論 SRF可顯著抑制HepG2荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且作用呈濃度依賴。其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2-Caspase-3通路與抑制信號(hào)通路上游NF-κB-p65及VEGF等因子的蛋白質(zhì)表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 芍藥軟肝方;肝癌;HepG2;分子機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）07-0038-04

Study of the inhibitory effect of Shaoyao Ruangan Formula on the growth of liver cancer in nude mice based on Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway and its mechanism

LI Junfei? ?ZHENG Xiaorong? ?JIANG Jianwei? ?ZHANG Hongyan

The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences（Zhejiang Cancer Hospital）， Institute of Basic Medicine and Cancer （IBMC）， Chinese Academy of Sciences， Hangzhou? 310022， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of Shaoyao Ruangan Formula（SRF） regulating Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway to inhibit the growth of liver cancer. Methods HepG2 tumor-bearing nude mouse models were established and randomly divided into the blank control group， the high， medium and low concentration SRF group. After three weeks of gastric perfusion， the tumors were weighed， the apoptosis of tumor cells was observed through the TUNEL method， and the protein expressions of NF-κB-p65， VEGF， Bcl-2， Bax and Caspase-3 in the tissues of different groups were detected by Western-blot method. Results （1）All SRF at variant concentrations can inhibit the growth of liver cancer in HepG2 tumor-bearing nude mice and induce the apoptosis of tumor cells; （2）SRF can decrease the protein expressions of NF-κB-p65， VEGF and Bcl-2 in liver cancer tissues of nude mice， and up-regulate the protein expressions of Bax and Caspase-3. The above-mentioned effects were all in a concentration-dependent manner. Conclusion SRF can significantly inhibit the growth of tumors in HepG2 tumor-bearing nude mice and promote the apoptosis of tumor cells in a concentration-dependent manner. The mechanism may be related to the inhibition of protein expressions of NF-κB-p65 and VEGF， etc. in the upstream of signaling pathway by regulating Bax/Bcl-2-Caspase-3 pathway.

[Key words] Shaoyao Ruangan Formula; Liver cancer; HepG2; Molecular mechanism

肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌）是一種發(fā)病率與死亡率均較高的惡性腫瘤疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球肝癌患者新發(fā)約84.4萬(wàn)，死亡約78.2萬(wàn)，其新發(fā)與死亡比接近1∶1，分列36種常見(jiàn)癌癥中的第6位及第4位[1]。我國(guó)是肝病大國(guó)，肝癌的新發(fā)率與死亡率更是常年居高不下，2015年我國(guó)肝癌患者新發(fā)39.2萬(wàn)余，死亡36.8萬(wàn)余，均位居第3位[2-4]。因此，肝癌的預(yù)防、治療始終是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界重點(diǎn)關(guān)注的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

中醫(yī)中藥治療是公認(rèn)的有效肝癌防治方式，亦是目前臨床抗肝癌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。芍藥軟肝方（Shaoyao Ruangan Formula，SRF）是由我院多位中醫(yī)師依據(jù)臨床治療經(jīng)驗(yàn)共同總結(jié)、研發(fā)的中藥抗肝癌協(xié)定方（當(dāng)前已開(kāi)發(fā)為院內(nèi)中藥制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：浙藥制Z20050184。曾用名：中肝合劑）。全方由白芍、三葉青、重樓、仙鶴草、白茅根、郁金、三棱、路路通等19味中藥組成，具有清熱解毒、行氣健脾等功效，對(duì)原發(fā)性肝癌療效顯著，受到患者與臨床醫(yī)生的廣泛認(rèn)可，臨床使用超過(guò)40年[5]。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了SRF具有抗H22肝癌裸鼠腫瘤及延長(zhǎng)患癌裸鼠生存期的作用，且初步揭示其抗腫瘤機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)[6]。但由于H22肝癌屬于鼠源性肝癌，與人源性肝癌有較大差異，且SRF的抗腫瘤作用及機(jī)制至今尚未被完全闡明。因此本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以人源性HepG2細(xì)胞及相應(yīng)裸鼠肝癌移植瘤模型為載體，圍繞SRF對(duì)Bax（BCL-2-associated X protein）/B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）-半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）通路及上游細(xì)胞核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）-NF-κB-p65及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的調(diào)控作用而進(jìn)一步闡釋該方抗肝癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 動(dòng)物與瘤株? 裸鼠20只，均3周齡，體重（20±2）g，雌雄各半，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2017-0005。HepG2細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物制備? 芍藥軟肝方由中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）提供，藥物低、中、高濃度為5 mL/kg、10 mL/kg、20 mL/kg。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器? DnaseI（Promega）、Bst DNA Polymerase（NEB）、總蛋白提取試劑盒（南京凱基生物）、BCA蛋白定量試劑盒（天根）、PVDF（merck）、SDS-PAGE制備試劑盒（杭州寶賽生物）。美國(guó)Agilent Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀、Bio-RAD垂直蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜儀、美國(guó)Bio-RAD公司Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis system、Bio-RADMini-sub cell GT水平電泳槽、AndyBio M-centrifuge微型離心機(jī)。Bcl-2抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司），批號(hào)ab692;Bax抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司），編號(hào)ab7977;VEGF抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司），編號(hào)ab69479;Caspase-3抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司），批號(hào)ab32351;NF-κB-p65抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司），批號(hào)ab76302;β-actin抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司），批號(hào)ab63982。

1.2.2 模型制備及分組? 培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下生理鹽水稀釋配制成細(xì)胞懸液備用。取裸鼠，左腋下注射2×107個(gè)HepG2細(xì)胞，制備HepG2肝癌裸鼠模型，共20只。實(shí)驗(yàn)共分為四組，每組5只，分別為SRF高、中、低劑量組及空白對(duì)照組，給藥組按劑量每日灌胃1次，空白對(duì)照組給予10 mL生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3周后處死裸鼠。

1.2.3 取材? 摘除裸鼠移植瘤，拍照、稱重，將非壞死部分凍存。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡? 取肝臟腫瘤組織置10%甲醛溶液中固定，脫水后石蠟包埋并常規(guī)切片。按試劑盒說(shuō)明書提示步驟操作對(duì)石蠟切片進(jìn)行檢測(cè)，以細(xì)胞核染成綠色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.2 Western-blot法檢測(cè)腫瘤組織中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)? 取腫瘤組織0.5 g制備細(xì)胞裂解液，按照全蛋白提取試劑盒提示按步驟提取樣品總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度，20 μg蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)模，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜。一抗室溫孵育2 h，TBST漂洗濾膜3次，每次10 min，TBS洗滌1次10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌液洗滌3次，每次10 min，TBS洗滌1次10 min。DAB顯色液臨用時(shí)配制。洗凈后的PVDF膜放入顯色液中反應(yīng)3 min（注意觀察），用水終止反應(yīng)，成像儀攝片，測(cè)定腫瘤組織中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間資料比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRF各組干預(yù)HepG2荷瘤裸鼠腫瘤重量比較

SRF給藥組腫瘤體積及重量均小于空白對(duì)照組。空白對(duì)照組裸鼠平均瘤重為（1.73±0.28）g、低劑量組瘤重為（1.10±0.17）g、中劑量組瘤重為（0.78±0.03）g、高劑量組瘤重為（0.45±0.04）g，其中中、高劑量組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明中、高濃度SRF具有顯著抑制HepG2荷瘤裸鼠肝癌生長(zhǎng)的作用，且呈濃度依。

2.2 SRF各組干預(yù)HepG2荷瘤裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL法檢測(cè)鏡下空白對(duì)照組熒光細(xì)胞僅零星可見(jiàn)，說(shuō)明僅有少量細(xì)胞凋亡。SRF各組熒光細(xì)胞均明顯多于空白對(duì)照組，且凋亡細(xì)胞數(shù)量隨藥物濃度升高而增多，高濃度組已呈現(xiàn)大片熒光細(xì)胞，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞凋亡程度最高。

2.3 Western-blot實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組相比，SRF各組干預(yù)后腫瘤組織樣本中VEGF、NF-κB-p65、Bcl-2等因子蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低而Caspase-3及Bax因子蛋白質(zhì)表達(dá)水平提高，且均呈濃度依賴。

3 討論

肝癌的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移受到多因素、多階段、多基因的共同調(diào)控[7]。腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡抑制及失控性無(wú)限制增殖被視為肝癌發(fā)生與惡化的重要機(jī)制[8]。Bax和Bcl-2是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族的成員，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。Bax與Bcl-2是一對(duì)具有相互拮抗作用的同源調(diào)控因子，它們形成二聚體后通過(guò)改變線粒體外膜的通透性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9，10]。Bax又稱造孔蛋白，激活后在線粒體膜外膜形成孔洞，導(dǎo)致膜完整性喪失和細(xì)胞色素釋放[11]，因此Bax是重要的促凋亡因子，參與線粒體凋亡途徑，而抗凋亡因子Bcl-2可抑制Bax的功能。簡(jiǎn)言之，Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2則抑制凋亡，Bax及Bcl-2間的比率決定了它們誘導(dǎo)凋亡作用的強(qiáng)弱，當(dāng)Bcl-2表達(dá)顯著增加時(shí)，腫瘤細(xì)胞將表現(xiàn)出明顯的凋亡抑制現(xiàn)象[12，13]。Caspase是細(xì)胞凋亡通路中另一類關(guān)鍵調(diào)控因子，它們具有促細(xì)胞凋亡作用[14]，通?？煞譃閱?dòng)型，包括：Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10和效應(yīng)或執(zhí)行型，包括：Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7[15]。當(dāng)Bax/Bcl-2二聚體中Bax表達(dá)增加時(shí)將激活Caspase-9，然后Caspase-9又通過(guò)酶切酶原激活Caspase-3，促使Caspase-3進(jìn)行剪切，從而開(kāi)啟凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，催化多種關(guān)鍵細(xì)胞蛋白分解，使細(xì)胞凋亡[16，17]。因此，Bax/Bcl-2-Caspase-3是腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中常見(jiàn)的重要調(diào)控因子[18]。

NF-κB是一種由50 ku和65 ku蛋白組成的異源二聚體，在正常條件下與IκBs形成復(fù)合物，保持在靜息狀態(tài)[19]。當(dāng)受到外界因素，如缺氧、細(xì)胞因子、病毒蛋白、有絲分裂原和紫外線等刺激時(shí)，IκBs被降解，形成三聚體復(fù)合物中的IκB被磷酸化，與NF-κB解離，隨后NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，作用于靶因子，發(fā)揮其功能[19-20]。NF-κB是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種基因的表達(dá)，如凋亡相關(guān)基因、癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶等，尤其是上調(diào)VEGF基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中扮演重要作用，與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21]。研究表明，NF-κB活化在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，是肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[22-23]。活化的NF-κB可增加抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)[24]。因此Bax/Bcl-2-Caspase-3信號(hào)通路受到NF-κB及VEGF等上游因子的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)NF-κB表達(dá)受到抑制時(shí)，Bax/Bcl-2-Caspase-3通路中Bax及Caspase-3等促凋亡因子表達(dá)將顯著上調(diào)，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞凋亡[25]。VEGF是促進(jìn)腫瘤周圍及新血管生成、控制腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控因子，在肝癌中呈高表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及凋亡均有重要作用[26]。研究表明，當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）/VEGF通路被激活，繼而通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2/Caspase-3通路促使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡抑制反應(yīng)[27]。Song等[28]研究則進(jìn)一步闡明，ROS-NF-κB信號(hào)通路位于HIF-1α/VEGF通路上游，并對(duì)其具有調(diào)控作用。因此，認(rèn)為在肝癌的發(fā)生及惡性化過(guò)程中可能存在NF-κB/VEGF/Bax/Bcl-2-Caspase-3信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡機(jī)能。

SRF全方由19味中藥組成，其中麩白芍、郁金柔肝利膽，行氣解瘀，重樓、白花蛇舌草、白毛藤、三葉青、半枝蓮解毒散結(jié)，清熱消腫，莪術(shù)、三棱行氣化瘀，破血消積，金錢草、白茅根利尿消腫，陳皮、青皮理氣降逆，焦山楂、炒雞內(nèi)金消積健脾，以其為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的院內(nèi)制劑芍藥軟肝合劑一直是我院治療肝癌的臨床常用藥物之一，深受醫(yī)師及患者青睞，但其作用機(jī)制尚未闡明?；谏炙庈浉畏皆谂R床中的療效，本文設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，利用各種實(shí)驗(yàn)方法探討其在動(dòng)物水平方面研究其抗腫瘤機(jī)制。最終本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SRF可顯著抑制HepG2荷瘤裸鼠腫瘤組織生長(zhǎng)，且抑制效果呈濃度依賴性，其中以高濃度SRF作用最強(qiáng)。TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，不同濃度的SRF都可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，也隨著濃度的增加而加強(qiáng)。Western-blot研究顯示SRF可抑制腫瘤組織中NF-κB、VEGF及Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。

綜上所述，SRF在動(dòng)物水平可起到較好的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞NF-κB及VEGF的蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)調(diào)控Bax/Bcl-2/Caspase-3信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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（收稿日期：2020-05-06）