毛 盼，葉長蕓

單增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)是一種兼性厭氧的革蘭陽性食源性病原菌，可引起人或動物的流產(chǎn)、敗血癥、腦膜炎、腦膜腦炎等嚴(yán)重疾病。免疫力缺陷或低下的人群易感，致死率高達(dá)20%～30%[1]。單增李斯特菌以胞內(nèi)寄生的方式引起動物和人類患李斯特菌病，亦以腐生方式存在于環(huán)境中，廣泛分布于土壤、農(nóng)作物、污水、動物和食物環(huán)境。單增李斯特菌具有很強(qiáng)的抵抗多種不同應(yīng)激壓力的能力，包括廣范圍的pH條件、不同溫度、高鹽、消毒劑等[2]。單增李斯特菌可形成生物膜持續(xù)定植于食品加工環(huán)境，易造成交叉污染而引起食源性感染暴發(fā)。單增李斯特菌具有高致病性、分布廣、耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)，是威脅食品安全和引起公共衛(wèi)生問題的重要病原菌之一。

單增李斯特菌具有強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力，單增李斯特菌質(zhì)粒與其抗逆性有關(guān)。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外具有遺傳功能的DNA，非細(xì)菌生長代謝的必需元件，在輔助宿主菌的生存和適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。質(zhì)粒可介導(dǎo)細(xì)菌間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，使受體菌獲得供體菌的選擇性優(yōu)勢，如抗逆性、毒力、耐藥等。上世紀(jì)80年代，Perez-Diaz等[3]首次報(bào)道了單增李斯特菌質(zhì)粒，后來的研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒在單增李斯特菌中分布廣泛，并發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。本文將對單增李斯特菌質(zhì)粒的分類、分布以及生物學(xué)特性等研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 單增李斯特菌質(zhì)粒分類及分布

Kuenne等[4]對李斯特菌屬14個(gè)質(zhì)?；蚪M進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)所有質(zhì)粒為同一種復(fù)制子類型，屬于θ復(fù)制質(zhì)粒pAMbeta1，提示這些質(zhì)粒為同一祖先來源，該質(zhì)粒復(fù)制子的宿主譜很廣，具有在屬內(nèi)菌株間水平轉(zhuǎn)移的潛能。多項(xiàng)研究根據(jù)李斯特菌質(zhì)粒repA基因，對質(zhì)粒進(jìn)行分類[3，7]。目前Hingston等[5]研究對單增李斯特菌質(zhì)粒分類較為全面，分為G1和G2兩個(gè)組別，G2又分成兩個(gè)亞組。G1質(zhì)粒(26～88 kbp)較小但攜帶更多的可移動元件(如前噬菌體、轉(zhuǎn)座子、插入序列)，G2質(zhì)粒(55～107 kbp)較大，G2組的sub2亞組質(zhì)粒均編碼毒力相關(guān)蛋白(如細(xì)胞表面蛋白、分泌蛋白E)。G2質(zhì)粒的GC含量(36.6%～37.7%)稍高于G1質(zhì)粒(34.4%～36.9%)。所有質(zhì)粒均編碼RepA(質(zhì)粒復(fù)制機(jī)制)、RepB(質(zhì)粒分配機(jī)制)以及核酸外切酶(DNA修復(fù)機(jī)制)。同一單增李斯特菌菌株的不同基因片段中出現(xiàn)多個(gè)repA基因現(xiàn)象，提示存在多質(zhì)粒的可能性，NCBI基因組數(shù)據(jù)中已發(fā)現(xiàn)在1株單增李斯特菌中存在5個(gè)質(zhì)粒[5,8-9]。已有報(bào)道采用PCR方法擴(kuò)增不同類型的復(fù)制子對大腸桿菌等細(xì)菌的質(zhì)粒進(jìn)行分型[10]，而關(guān)于單增李斯特菌質(zhì)粒尚無統(tǒng)一的分型標(biāo)準(zhǔn)。

研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌中質(zhì)粒的攜帶率為28%～90%，大小為14～106 kbp[11]。相比臨床菌株，質(zhì)粒在環(huán)境和食品源性的菌株中更為常見。食源性單增李斯特菌中持續(xù)性菌株的質(zhì)粒分離率高達(dá)75%，而散發(fā)菌株的質(zhì)粒分離率為35%[11]，提示質(zhì)粒對宿主菌在環(huán)境中的生存能力和適應(yīng)性具有一定輔助作用。部分型別的單增李斯特菌中攜帶同一高度保守質(zhì)粒，如ST121型、ST204型[12-14]，ST8型單增李斯特菌的質(zhì)粒分為兩個(gè)組別(n=10)，兩組質(zhì)粒序列差異顯著，但每個(gè)組別內(nèi)的質(zhì)粒序列高度保守[15]。

早期研究單增李斯特菌質(zhì)粒主要通過PCR擴(kuò)增repA基因檢測質(zhì)粒的存在。近年來隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)粒譜和比較基因組學(xué)研究取得重大進(jìn)展。Naditz等[9]分析了32個(gè)國家近60年來的1 924株單增李斯特菌基因組，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒總分離率為53%，大小為3～140 kbp。這些質(zhì)粒基因具有高度保守性，核苷酸同源性最低為91.9%。該研究發(fā)現(xiàn)ST121、ST5、ST3、ST8、ST204型菌株質(zhì)粒攜帶率較高(>50%)，ST1和ST2型菌株質(zhì)粒攜帶率較低(<15%)，ST4型菌株均不攜帶質(zhì)粒。質(zhì)粒攜帶率與菌株類型有關(guān)，部分質(zhì)粒僅存在于特定型別的單增李斯特菌，如pLM6179僅在ST121型菌中檢測出[9,11-12]，而部分質(zhì)粒分布廣泛，如質(zhì)粒pLMG1-7、pLMG2-7存在于多個(gè)單增李斯特菌血清型菌株，并在多個(gè)國家分離菌株中存在，但具體功能不明[5]。

2 單增李斯特菌質(zhì)粒的生物學(xué)功能

2.1質(zhì)粒相關(guān)功能基因 已有研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌質(zhì)粒攜帶功能基因分別與重金屬抗性、消毒劑抗性、氧化應(yīng)激抗性、熱抗性、鹽抗性、毒力、耐藥性等相關(guān)(表1)。 IV型分泌系統(tǒng)在質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要作用。毒素抗毒素系統(tǒng)編碼一種穩(wěn)定的毒素及一種不穩(wěn)定的抗毒素，為質(zhì)粒解離后致死系統(tǒng)(PSK)，具有維持質(zhì)粒穩(wěn)定存在的功能。雖然維持質(zhì)粒基因的穩(wěn)定對宿主具有一定負(fù)擔(dān)，但其功能基因在特定條件下發(fā)揮作用有利于宿主菌的生存。

表1 單增李斯特菌質(zhì)粒功能相關(guān)因子Tab.1 Plasmid-associated function factors in L. monocytogenes

2.2 環(huán)境壓力抵抗能力

2.2.1苯扎溴氨抗性 苯扎溴銨等季銨化合物消毒劑被廣泛應(yīng)用于食品加工和醫(yī)療環(huán)境的消毒。長期頻繁地使用消毒劑導(dǎo)致抗性菌株的產(chǎn)生并在環(huán)境中定植，可通過交叉污染轉(zhuǎn)移至食品中或造成院內(nèi)感染。關(guān)于單增李斯特菌質(zhì)粒攜帶的bcrABC基因介導(dǎo)苯扎溴銨抗性的研究較多，Dutta V等[25]發(fā)現(xiàn)116株不同來源的單增李斯特菌中71株具有苯扎溴銨抗性，除了1株外均含bcrABC基因。Xu D等[16]發(fā)現(xiàn)攜帶bcrABC的質(zhì)?？伤睫D(zhuǎn)移至大腸桿菌。Elhanafi等[26]在1998—1999年多地李斯特菌病的暴發(fā)菌株中均檢測出苯扎溴銨抗性相關(guān)的質(zhì)粒pLMST6，消除該質(zhì)粒后菌株的苯扎溴銨抗性減弱，野生株在苯扎溴銨刺激后外排泵EmrC及其TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高。

2.2.2重金屬抗性 單增李斯特菌廣泛分布于土壤、污水、動物和食品等環(huán)境中。環(huán)境中的重金屬污染廣泛，重金屬穩(wěn)態(tài)對單增李斯特菌維持雙重腐生和寄生方式至關(guān)重要[27]。單增李斯特菌質(zhì)粒常攜帶重金屬抗性(如鎘、銅、鋅、汞、砷抗性)，關(guān)于鎘抗性的研究較多。金屬鎘在農(nóng)業(yè)和工業(yè)中的廣泛使用，如污水排放、垃圾焚燒和化肥施用，鎘污染出現(xiàn)在土壤、水和空氣中，并最終進(jìn)入食物鏈。質(zhì)粒的鎘耐受基因盒編碼P-ATP依賴的鎘外排泵(cadA)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(cadC)。與染色體上的基因cadA4相比，質(zhì)粒攜帶的抗性基因可產(chǎn)生更強(qiáng)的鎘抗性[5,28]。質(zhì)粒編碼的CadA1和CadC1常位于Tn5422轉(zhuǎn)座子上，質(zhì)粒攜帶鎘抗性基因率較高可能與此轉(zhuǎn)座子有關(guān)。部分質(zhì)粒亦編碼CadA2、CadC2，如pLM80[16]。在質(zhì)粒鎘抗性基因附近常攜帶其他金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體和多銅氧化酶(Mco)[29]。

2.2.3其他抗性 近年來，單增李斯特菌質(zhì)粒與宿主菌抵御各種惡劣環(huán)境的關(guān)系備受關(guān)注。Naditz等[11]對持續(xù)性菌株的基因組特征分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒p4KSM(ST5)、pLMR479a(ST8)、pLM6179(ST121)在特定ST型別菌株中分離率高，提示這些質(zhì)粒可通過提高宿主菌對高鹽、氧化應(yīng)激等耐受性而利于宿主菌的生存。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pLMSZ08可促進(jìn)宿主菌形成生物膜，該質(zhì)粒消除后細(xì)菌的生物膜形成能力減弱，但質(zhì)粒上生物膜形成相關(guān)的基因尚未明確。Pontinen等[20]發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pLM58編碼的ClpL(熱休克蛋白 HSP100亞家族)可提高宿主的耐熱能力。Hingston等[5]發(fā)現(xiàn)Npx、Gbu前體、多金屬轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶在單增李斯特菌質(zhì)粒中較為多見，在6% NaCl和pH5.0條件下，質(zhì)?；騨px、cadA1、mco、clpL的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，提示質(zhì)粒的存在與抗酸和抗鹽有關(guān)。Npx 和Gbu前體相鄰存在，緊鄰3個(gè)假設(shè)蛋白和1個(gè)多金屬轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，移動轉(zhuǎn)座元件位于這整個(gè)區(qū)域的兩端，提示這些基因具有可轉(zhuǎn)移性和功能性。單增李斯特菌的環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)，了解其在不良條件下的生存和持續(xù)存在機(jī)制對食品加工環(huán)境的污染控制至關(guān)重要。

2.3致病性 毒力相關(guān)質(zhì)粒通常為大的(>40 kbp)低拷貝元件，編碼促進(jìn)宿主-病原體相互作用的基因[31]。毒力相關(guān)質(zhì)粒的作用也不容忽視，是腸桿菌科引起人類腹瀉的重要原因。Den Bakker等[32]首次報(bào)道單增李斯特菌潛在毒力相關(guān)質(zhì)粒pLMIV上具有毒力相關(guān)的編碼基因inlA、inlB、inlC和prf。Rychli等[33]發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒的21 kbp片段(內(nèi)化素家族)也在澳大利亞單增李斯特菌病暴發(fā)菌株的染色體上存在。細(xì)菌可能在長期進(jìn)化過程將有利的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到染色體上從而避免了維持質(zhì)粒的成本[34]。Kropac等[19]運(yùn)用斑馬魚胚胎模型證實(shí)質(zhì)粒pLMST6可在一定程度提高宿主菌的毒力。G2組sub2亞組的質(zhì)粒編碼多種毒力相關(guān)基因，但這些基因是否發(fā)揮功能及其機(jī)制尚不清楚[5]。

2.4耐藥性 目前全球的抗生素耐藥性危機(jī)主要與質(zhì)粒介導(dǎo)的抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes，ARG)傳播有關(guān)[35-36]。關(guān)于中國單增李斯特菌質(zhì)粒攜帶耐藥基因的報(bào)道較少。但亦有報(bào)道單增李斯特菌質(zhì)粒pNH1的轉(zhuǎn)座子攜帶新型多重耐藥基因簇，使其對多種抗生素耐藥[22]。在食品、臨床樣本中檢出多重耐藥結(jié)合質(zhì)粒pIP811、pLM78，其可在種內(nèi)轉(zhuǎn)移及跨屬傳播[23-24,37]。通過組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌多個(gè)質(zhì)粒攜帶多藥外排泵EbrAB，具體功能尚未進(jìn)一步研究，但在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中已證實(shí)此外排泵與溴化乙錠、丫啶黃抗性有關(guān)。有研究提示EbrAB多藥外排泵在細(xì)菌的毒力、膽汁抗性、消毒劑抗性中發(fā)揮一定的作用[38-39]。一些多藥外排泵，如單增李斯特菌外排泵ErmC[19]，通過分泌周期性di-AMP來觸發(fā)受感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素。單增李斯特菌耐藥率較低，但質(zhì)?？勺鳛槭澄镦溕夏退幓虻膬π畛?，李斯特菌屬可通過來自腸球菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移獲得多重耐藥性[24]。耐藥基因的攜帶可使宿主菌對抗生素產(chǎn)生抗性，從而導(dǎo)致臨床抗生素治療無效，對微生物種群中質(zhì)粒相關(guān)耐藥機(jī)制的研究有利于積極應(yīng)對抗生素耐藥性的產(chǎn)生及流行。

2.5質(zhì)?；虻乃絺鞑?基因可通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等水平傳播(HGT)方式在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移?；蛩絺鞑ナ羌?xì)菌進(jìn)化的重要驅(qū)動力，是細(xì)菌間傳遞抗性、毒力、耐藥性，并使細(xì)菌獲得新的生存特性的重要途徑。質(zhì)粒在復(fù)制或結(jié)合轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生基因序列的重排、刪除或插入，導(dǎo)致質(zhì)粒大小及功能的改變。在質(zhì)粒進(jìn)化過程中，質(zhì)粒的功能基因亦可轉(zhuǎn)移至染色體上，從而穩(wěn)定的賦予宿主菌特定的功能。目前報(bào)道攜帶功能基因的單增李斯特菌質(zhì)粒上IS插入序列、整合子較少，攜帶鎘抗性基因的轉(zhuǎn)座子Tn5422常見于單增李斯特菌質(zhì)粒[40]。已有關(guān)于單增李斯特菌質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移的報(bào)道，如耐藥質(zhì)粒pLM78可轉(zhuǎn)移至鏈球菌、耐藥質(zhì)粒pIP811可轉(zhuǎn)移至糞腸球菌[23]，以及苯扎溴銨抗性質(zhì)粒pLMST6可在單增李斯特菌間轉(zhuǎn)移，并可能與致病性相關(guān)[19]。Ghigo等[41]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合質(zhì)?？纱偈股锬さ男纬桑崾窘Y(jié)合性質(zhì)?？赡苁窃簝?nèi)持續(xù)性感染的原因，同時(shí)增加了毒力因子在菌株間轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。攜帶環(huán)境相關(guān)抗性基因的結(jié)合性質(zhì)粒有助于宿主菌的生存，并可在種群中傳播以維持宿主菌的持續(xù)存在，具有高毒力相關(guān)因子和多重耐藥因子的結(jié)合性質(zhì)粒的菌株是引起臨床感染暴發(fā)的原因，因此具有重要的公共衛(wèi)生意義。

3 展 望

質(zhì)粒是微生物功能基因的儲蓄池和傳播者。目前對單增李斯特菌質(zhì)粒的認(rèn)識和研究中已明確功能的質(zhì)粒基因并不多，許多質(zhì)粒編碼的假想蛋白基因還有待深入研究。有研究采用多種方法消除細(xì)菌中的質(zhì)粒，可降低甚至消除細(xì)菌的耐藥性，使細(xì)菌恢復(fù)對抗生素的敏感性，降低抗菌藥物的用量，提高臨床療效，也是未來應(yīng)對細(xì)菌耐藥的策略之一[42-43]。能否研發(fā)一種有效的質(zhì)粒消除方法應(yīng)用于食品加工環(huán)境中的細(xì)菌，以清除持續(xù)性交叉污染的菌株，同時(shí)減弱攜帶毒力相關(guān)質(zhì)粒菌株的致病性。盡管對單增李斯特菌質(zhì)粒分布狀況已有較全面的了解，但單增李斯特菌質(zhì)粒的分類、功能和作用機(jī)制等仍有待進(jìn)一步的研究。

利益沖突：無