黃永娜　宣德春　梁榮　宋海鑫　苗晉鋒　張金秋

摘要：溫敏型水凝膠在藥物或抗原富集、緩釋、控釋等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。為獲得一種可用于注射的、在生理溫度附近具有良好相變可控性的溫敏型水凝膠，試驗(yàn)分析了F127、F68、HPMC等不同組分對(duì)成膠行為的影響，通過測(cè)定并比較不同配方的凝膠溫度、凝膠時(shí)間等，篩選到6個(gè)符合最優(yōu)成膠條件的溫敏型水凝膠配方，其在室溫下為無(wú)色透明液體，通針性良好，在溫度為37℃時(shí)可快速轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w凝膠態(tài)，成膠時(shí)間約3min。本試驗(yàn)篩選出的溫敏型水凝膠配方為后續(xù)在疫苗佐劑方面的應(yīng)用提供了基本試驗(yàn)資料。

關(guān)鍵詞：溫敏型水凝膠;凝膠溫度;凝膠時(shí)間;泊洛沙姆

中圖分類號(hào)：S852.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）04-0120-05

作者簡(jiǎn)介：黃永娜（1994—），女，山東日照人，碩士，主要從事畜禽疫病防控方向的研究。E-mail：1271794375@qq.com。

通信作者：張金秋，副研究員，主要從事畜禽疫病防控研究。E-mail：jqzh03@126.com。

溫敏型水凝膠（temperaturesensitivehydrogel）是目前研究較為廣泛的原位水凝膠之一，能夠?qū)ν饨绛h(huán)境溫度的變化作出及時(shí)響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)溶液—凝膠的相轉(zhuǎn)變，在生物醫(yī)藥、組織工程、細(xì)胞工程等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值[1]。特別是在藥物控釋方面，溫敏型水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以將藥物包裹在內(nèi)，形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，有助于提高藥物的載量。隨著凝膠在體內(nèi)的降解或溶蝕，藥物緩慢釋放，可避免藥物的首過效應(yīng)，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，從而達(dá)到持續(xù)給藥的目的[2]。另外，一些蛋白類藥物進(jìn)入機(jī)體后，很容易被酶類物質(zhì)降解，使藥效得不到充分發(fā)揮，而利用溫敏型水凝膠作為蛋白類藥物的載體，可以顯著減緩蛋白類藥物的降解速度，借助緩釋作用提高藥物的生物利用度[3]。

溫敏型水凝膠的這一特征提示其可以作為優(yōu)良的抗原載體，即可以用作疫苗佐劑，一方面有利于富集抗原，形成抗原儲(chǔ)庫(kù)，另一方面可以通過緩控釋功能，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原與機(jī)體免疫系統(tǒng)的接觸，模擬疫苗多次免疫的效果，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。因此，本研究選擇生物相容性良好的高分子聚合物等作為凝膠基質(zhì)，篩選不同物質(zhì)的濃度及配伍比例，旨在制備一種適用于注射的溫敏型水凝膠，為后續(xù)的疫苗研發(fā)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1主要試劑

泊洛沙姆407（Poloxamer407，F(xiàn)127，SigmaAldrich公司）;泊洛沙姆188（Poloxamer188，F(xiàn)68，SigmaAldrich公司）;羥丙基甲基纖維素（HPMC，SigmaAldrich公司）;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2主要儀器設(shè)備

數(shù)顯磁力攪拌器，江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱;超聲儀，上海聲浦超聲波設(shè)備廠生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司生產(chǎn);DSC8500差示掃描量熱儀，美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn);流變儀MCR301，奧地利AntonPaar公司生產(chǎn)。

1.3配方的篩選

采用冷法制備溫敏型水凝膠[4]。準(zhǔn)確稱量泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羥丙基甲基纖維素等高分子材料，溶于適量超純水中，于冰水浴條件下充分混合均勻，4℃冰箱過夜使其充分溶脹。

1.3.1F127對(duì)成膠行為的影響選取的F127的濃度為30%，HPMC的濃度為2.5%，調(diào)整F127∶HPMC的體積比分別為7∶1、6∶1、5∶2、4∶3、5∶1、4∶1、3∶1，觀察其成膠溫度的變化，考察F127的含量對(duì)凝膠行為的影響。

1.3.2F68對(duì)成膠行為的影響選取的F127的濃度為30%，HPMC的濃度為2.5%，F(xiàn)68的濃度為10%，調(diào)整F127∶F68∶HPMC的體積比分別為7∶1∶1、6∶1∶1、5∶1∶1、4∶1∶1，考察F68的含量對(duì)凝膠行為的影響。

1.3.3HPMC對(duì)成膠行為的影響選取的F127的濃度為30%，F(xiàn)68的濃度為10%，HPMC的濃度為2.5%，調(diào)整F127∶F68∶HPMC的體積比分別為7∶1∶0.5、7∶1∶1、6∶1∶0.5、6∶1∶1、5∶1∶0.5、5∶1∶1、4∶1∶0.5、4∶1∶1，考察HPMC的含量對(duì)凝膠行為的影響。

1.4凝膠時(shí)間的測(cè)定

采用倒置法，將配制好的溫敏性凝膠水溶液放置在培養(yǎng)箱中，自29℃開始升溫，控制升溫速度在1℃/2min，每隔2min倒置傾斜觀察，與水平面夾角成60°，以30s內(nèi)液體不流動(dòng)作為成膠判定依據(jù)，記錄膠凝溫度和膠凝時(shí)間。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.5流變儀測(cè)定溫敏型水凝膠的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度及黏彈性

按“1.3”節(jié)的方法制備樣品后，經(jīng)流變儀MCR301測(cè)定樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）。設(shè)定應(yīng)變值為10%，角頻率Ω為2rad/s，升溫范圍為10～50℃，升溫速度為2℃/min，10℃保溫2min，樣品測(cè)量厚度為0.5mm。觀察溫敏型水凝膠的儲(chǔ)模量G′和失模量G″隨溫度的模量變化情況，計(jì)算損耗因子tanδ的值。

2結(jié)果與分析

2.1溫敏型水凝膠的形態(tài)變化

從圖1可以看出，在室溫下該溫敏型水凝膠為具有良好流動(dòng)性的無(wú)色透明液體，且流動(dòng)性與溫度呈反向相關(guān)關(guān)系，即溫度越低，流動(dòng)性越好，溫度為37℃時(shí)為不流動(dòng)的半固體凝膠態(tài)。室溫下經(jīng)1mL注射器注射試驗(yàn)，該溫敏型水凝膠通針性良好。

[FK（W9][TPHYN1.tif][FK）]

2.2F127對(duì)成膠行為的影響

從表1可以看出，溫度升至39℃時(shí)，體積比為5∶2、4∶3、3∶1的體系仍不能成膠，對(duì)應(yīng)F127的實(shí)際濃度為21.43%、17.14%、22.5%。由此篩選出可形成凝膠的試驗(yàn)組別7∶1、6∶1、5∶1和4∶1，用于后續(xù)試驗(yàn)。由F127：HPMC組成的體系中，F(xiàn)127的最低成膠濃度為24%，且F127的濃度越大，成膠溫度越低。

2.3F68對(duì)成膠行為的影響

在F127與HPMC體積比不變的情況下，僅改變F68的體積占比，考察成膠時(shí)間與成膠溫度的關(guān)系。從表2可以看出，提高F68的含量，體系的膠凝時(shí)間明顯增加。當(dāng)F68的含量進(jìn)一步增加，即F127∶F68∶HPMC的體積比為7∶3∶1.5、7∶4∶1.5時(shí)，體系在39℃以下均不能成膠。

2.4HPMC對(duì)成膠行為的影響

從表3可以看出，當(dāng)固定F127與F68的比例時(shí)，增加HPMC的體積比能夠提高該溫敏型水凝膠的成膠溫度。同時(shí)，F(xiàn)127的含量越低，體系的成膠溫度越高，當(dāng)F127∶F68∶HPMC的體積比為4∶1∶1時(shí)，即使溫度升至39℃，體系依然不能成膠。

2.5不同配方的凝膠時(shí)間比較

根據(jù)上述各因素對(duì)膠凝溫度和膠凝時(shí)間的影響，設(shè)計(jì)各種高分子物質(zhì)的比例，比較不同凝膠配方在不同溫度的成膠時(shí)間。從表4可以看出，上述各組配方在36～38℃的成膠時(shí)間均在3min左右，且隨著配方中[KG*8]F127[KG*8]和[KG*8]HPMC[KG*8]含量的升高，相同溫度下體系的膠凝時(shí)間逐漸縮短。

2.6溫敏型水凝膠的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度及黏彈性測(cè)定

以F127∶F68∶HPMC（體積比）=7∶1∶1.5的配方為例，通過流變儀測(cè)定該配方的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度及黏彈性。從圖2-a可以看出，在10～25℃，樣品的儲(chǔ)能模量和損耗模量均無(wú)明顯變化。溫度繼續(xù)升高到25℃以上，儲(chǔ)能模量和損耗模量均開始明顯增加，但儲(chǔ)能模量<損耗模量，體系處于液態(tài)或黏性態(tài);溫度升高至33℃時(shí)，儲(chǔ)能模量與損耗模量相當(dāng)，體系由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w凝膠態(tài)，此溫度即為該溫敏型水凝膠的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，儲(chǔ)能模量>損耗模量，體系已完全轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w凝膠態(tài)。該溫敏型水凝膠在狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中模量變化范圍為0～2000Pa。損耗因子tanδ為損耗模量與儲(chǔ)能模量的比值，代表了體系的黏彈性。tanδ值越低，體系的黏彈性越大。從圖2-b可以看出，在體系處于流動(dòng)態(tài)時(shí)，tanδ值較高;當(dāng)體系成膠后，樣品的儲(chǔ)能模量大于損耗模量，tanδ值明顯下降，凝膠體系的黏彈性增大。

3討論與結(jié)論

溫敏型水凝膠良好的生物相容性和相轉(zhuǎn)變的可控性，使其成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。因制備溫敏型水凝膠的材料來(lái)源不同，凝膠的特性也具有很大差異。如殼聚糖、纖維素、透明質(zhì)酸等天然物質(zhì)制備的溫敏型水凝膠，生物相容度良好，已在藥物控釋、組織修復(fù)等方面有廣泛研究及應(yīng)用。但殼聚糖溶解性較差，需要溶解在弱酸中，且殼聚糖的脫乙酰度對(duì)于體系能否成膠有重要影響[5]。研究表明，殼聚糖的脫乙酰度要達(dá)到85%以上，并加入一些物質(zhì)，如β-甘油磷酸鈉等，對(duì)化學(xué)鍵進(jìn)行改性或修飾，才可能形成凝膠體系。這些復(fù)雜的操作在很大程度上限制了殼聚糖溫敏型水凝膠的應(yīng)用[6-7]。此外，透明質(zhì)酸類溫敏型水凝膠的機(jī)械性能較差，凝膠強(qiáng)度不夠，易被酶解，通常需要進(jìn)行物理或化學(xué)交聯(lián)，以改善凝膠性能。

聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物等高分子合成材料具有良好的水溶性、溫度敏感性及生物安全性，近年來(lái)已在黏膜給藥系統(tǒng)、經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中得以應(yīng)用。本研究所選用的泊洛沙姆407（F127）、泊洛沙姆188（F68）均屬于聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，但聚氧乙烯和聚氧丙烯的比例不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)127的最佳成膠濃度范圍為18%～30%，濃度低于18%，溶液即使升至很高的溫度也不能成膠;濃度高于30%時(shí)，在室溫或更低溫度下就可能成膠，并且高濃度的水凝膠在制備過程中會(huì)更加困難[8]。因此單獨(dú)使用F127難以獲得在正常體溫范圍的可用于注射的溫敏型凝膠劑。F68單獨(dú)不能成膠，能在一定程度上起到消泡的作用，常用作穩(wěn)定劑[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加F68的含量，有助于提升F127體系的凝膠溫度，同時(shí)降低體系濃度。羥丙基甲基纖維素（HPMC）在口服藥物中常充當(dāng)藥物賦型劑或輔料，在眼科用藥時(shí)常被作為潤(rùn)滑劑[10]。HPMC本身的膠凝溫度較高，本研究將HPMC加入溫敏型水凝膠體系中，可以提高體系的成膠溫度，能避免體系在室溫下過快膠凝。同時(shí)，HPMC也可以作為懸浮劑，使體系更加均一穩(wěn)定，增加生物黏附性[11]。

流變儀測(cè)定法是目前比較常用的衡量溫敏型水凝膠玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的方法。通常情況下，儲(chǔ)能模量又稱為彈性模量，是指材料在發(fā)生形變時(shí)，由于彈性形變而儲(chǔ)存能量的大小，反映材料彈性大小;損耗模量又稱黏性模量，是指材料在發(fā)生形變時(shí)，由于黏性形變而損耗的能量大小，反映材料黏性大小。當(dāng)儲(chǔ)能模量遠(yuǎn)大于損耗模量時(shí)，材料主要發(fā)生彈性形變，所以材料呈固態(tài);當(dāng)損耗模量遠(yuǎn)大于儲(chǔ)能模量時(shí)，材料主要發(fā)生黏性形變，所以材料呈液態(tài);當(dāng)儲(chǔ)能模量和損耗模量相當(dāng)時(shí)，材料為半固態(tài)。本研究以F127∶F68∶HPMC（體積比）=7∶1∶1.5的配方為例，發(fā)現(xiàn)溫度約33℃時(shí)，體系的儲(chǔ)能模量與損耗模量相當(dāng)，判斷在此溫度下，體系發(fā)生相轉(zhuǎn)變，呈凝膠態(tài)。另外，不同的材料表現(xiàn)出的狀態(tài)轉(zhuǎn)變也有很大差異[12-13]。如Supper等發(fā)現(xiàn)，殼聚糖水凝膠的黏彈性變化較為緩和，模量變化范圍在0～800Pa之間[14]。而本試驗(yàn)所得的溫敏型水凝膠的模量變化范圍為0～2000Pa，表明泊洛沙姆及羥丙基甲基纖維素構(gòu)成的凝膠體系強(qiáng)度更大，推測(cè)該類高分子聚合物材料形成的溫敏型水凝膠可能具有更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或類固體性能。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用其他輔料可以調(diào)節(jié)泊洛沙姆類溫敏型凝膠的膠凝溫度、膠凝時(shí)間及凝膠強(qiáng)度[15-16]。如添加甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或具有黏膜黏附性的聚卡泊菲等，能夠增加凝膠強(qiáng)度，減緩藥物釋放速率，這與本試驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象相一致。

綜上所述，本研究以F127、F68、HPMC為基質(zhì)，通過分析不同組分對(duì)成膠行為的影響，篩選出了在生理溫度附近（37℃左右）具有良好相變可控性的溫敏型水凝膠的配方。該溫敏型水凝膠在室溫下流動(dòng)性良好，通針性佳，為后續(xù)進(jìn)行免疫增強(qiáng)效果評(píng)價(jià)提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯玉峰，杜予民.殼聚糖基可注射型溫度敏感性水凝膠[J].化學(xué)進(jìn)展，2008，20（2）：239-244.

[2]沈瑩.自微乳化胰島素經(jīng)鼻給藥系統(tǒng)的研究[D].上海：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，2005.

[3]王欣欣.姜黃素微丸及囊泡的制備工藝和生物利用度研究[D].青島：青島科技大學(xué)，2017.

[4]劉玲秀，胡幗穎，劉欣，等.溫敏型可注射水凝膠的制備研究[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，29（6）：901-908.

[5]WangQ，WangM，LiP，etal.TheinteractionofchitosanandBMP-2tunedbydeacetylationdegreeandpHvalue[J].JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2019，107（4）：769-779.

[6]BaoZ，JiangC，WangZ，etal.Theinfluenceofsolventformulationsonthermosensitivehydroxybutylchitosanhydrogelasapotentialdeliverymatrixforcelltherapy[J].CarbohydratePolymers，2017，170：80-88.

[7]孫斌，劉洪臣.可注射溫敏殼聚糖/甘油磷酸鈉基水凝膠在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用進(jìn)展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，9（1）：46-49.

[8]候冰娜，鄭澤鄰，趙梓年，等.可注射海藻酸鈉/泊洛沙姆復(fù)合水凝膠的制備及藥物緩釋研究[J].材料工程，2020（12）：60-67.

[9]DeyAK，BurkeB，SunY，etal.Useofapolyanioniccarbomer，Carbopol971P，incombinationwithMF59，improvesantibodyresponsestoHIV-1envelopeglycoprotein[J].Vaccine，2012，30（17）：2749-2759.

[10]MaheshB，KathyayaniD，NanjundaswamyGS，etal.Miscibility[JP4]studiesofplastic-mimeticpolypeptidewithhydroxypropylmethylcelluloseblendsandgenerationofnon-wovenfabrics[J].CarbohydratePolymers，2019，212：129-141.

[11]CostanzoS，PasquinoR，DonatoR，etal.Effectofpolymerconcentrationandthermalhistoryontheinversethermogelationofhydroxypropylcelluloseaqueoussolutions[J].Polymer，2017，132：157-163.[HJ1.98mm]

[12]Krezovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]BD，Miljkovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]MG，Stojanovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]ST，etal.Structural，thermal，mechanical，swelling，drugrelease，antibacterialandcytotoxicpropertiesofP（HEA/IA）/PVPsemi-IPNhydrogels[J].ChemicalEngineeringResearchandDesign，2017，121：368-380.

[13]Vukovic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]JS，Babic[DD（-1*2][HT6]'[DD）]MM，Anti[KG-*5]c[DD（-1*3][HT6]'[DD）]KM，etal.Invitrocytotoxicityassessmentofintelligentacrylatebasedhydrogelswithincorporatedcopperinwoundmanagement[J].MaterialsChemistryandPhysics，2016，175：158-163.

[14]SupperS，AntonN，SeidelN，etal.Rheologicalstudyofchitosan/polyol-phosphatesystems：influenceofthepolyolpartonthethermo-inducedgelationmechanism[J].Langmuir，2013，29（32）：10229-10237.

[15]HuangW，ZhangN，HuaH，etal.Preparation，pharmacokineticsandpharmacodynamicsofophthalmicthermosensitiveinsituhydrogelofbetaxololhydrochloride[J].Biomedicine&Pharmacotherapy，2016，83：107-113.

[16]KoffiAA，AgnelyF，PonchelG，etal.Modulationoftherheologicalandmucoadhesivepropertiesofthermosensitivepoloxamer-basedhydrogelsintendedfortherectaladministrationofquinine[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences，2006，27（4）：328-335.