棉花產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL定位及候選基因篩選

賈曉昀，朱繼杰，趙紅霞，王士杰，李 妙，王國(guó)印

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035)

棉花是世界上最重要的天然纖維作物，保證棉纖維的產(chǎn)量對(duì)紡織工業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)始終是棉花育種工作的重要目標(biāo)[1]。陸地棉在棉纖維年產(chǎn)量中占比95%以上[2]。因此，研究陸地棉產(chǎn)量相關(guān)性狀的分子遺傳機(jī)制，有助于進(jìn)一步培育高穩(wěn)產(chǎn)棉花新品種。

單鈴質(zhì)量(Boll weight，BW)、衣分(Lint percentage，LP)、子指(Seed index，SI)和果枝數(shù)(Fruit branch number，F(xiàn)BN)等是棉花產(chǎn)量的重要數(shù)量性狀，且性狀之間存在復(fù)雜的相互影響[3-4]。因此，QTL定位是進(jìn)行產(chǎn)量性狀分子遺傳機(jī)制挖掘的重要手段。Shen等[5]以陸地棉重組自交系為試驗(yàn)材料，基于一張包含110個(gè)SSR標(biāo)記、總圖距為810.07 cM的遺傳圖譜，定位到11個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL；隨后通過加密圖譜標(biāo)記，構(gòu)建了一張包含156個(gè)SSR標(biāo)記、總圖距1 024.4 cM的遺傳圖譜，定位到26個(gè)QTL[6]。Wang等[7]以海島棉F2群體為試驗(yàn)材料，構(gòu)建一張包含337個(gè)位點(diǎn)、圖距2 108.34 cM的遺傳圖譜，定位到21個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL位點(diǎn)。Yu等[8]以海陸種間回交自交系群體為試驗(yàn)材料，構(gòu)建一張包含392個(gè)SSR標(biāo)記、總圖距2 895 cM的遺傳圖譜，定位到39個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL。Ning等[9]以陸地棉重組自交系群體為試驗(yàn)材料，構(gòu)建一張包含279個(gè)SSR標(biāo)記、總圖距1 576.25 cM的遺傳圖譜，定位到61個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL。Liu等[10]以陸地棉重組自交系為試驗(yàn)材料，通過構(gòu)建一張包含2 051個(gè)位點(diǎn)、總圖距3 508.29 cM的遺傳圖譜，定位到37個(gè)產(chǎn)量相關(guān)QTL。由于缺乏參考基因組信息、SSR等傳統(tǒng)分子標(biāo)記多態(tài)性較差、圖譜構(gòu)建過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力等原因，前期的研究存在定位區(qū)間較大、染色體及基因信息不完整等不足之處。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，陸地棉參考基因組信息得以公布并不斷完善[11-14]。Zhang等[15]以陸地棉重組自交系群體為試驗(yàn)材料，開發(fā)SLAF-SNP(Specific locus amplified fragment sequencing-Single nucleotide polymorphism)標(biāo)記，構(gòu)建一張包含5 521個(gè)SNP、總圖距3 259.37 cM的高密度遺傳圖譜，定位到18個(gè)多環(huán)境穩(wěn)定存在的單鈴質(zhì)量QTL位點(diǎn)，注釋到344個(gè)基因。Su等[16]通過SLAF-seq技術(shù)，對(duì)355份陸地棉材料的衣分性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到12個(gè)高度關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，并推測(cè)基因Gh_A02G1268對(duì)衣分有重要影響。Ma等[17]對(duì)419份陸地棉材料進(jìn)行重測(cè)序及關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明Gh_D02G0025可能是影響衣分的關(guān)鍵基因。Sun等[3]以10 511個(gè)SNP對(duì)719份陸地棉材料的產(chǎn)量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到62個(gè)顯著相關(guān)的SNP，并發(fā)現(xiàn)基因Gh_D03G1064和Gh_D12G2354可能對(duì)產(chǎn)量有重要作用。Song等[18]用CottonSNP63K芯片對(duì)276份陸地棉材料衣分性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到23個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP和15個(gè)QTL位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)基因Gh_D05G0313和Gh_D05G1124在纖維發(fā)育階段高調(diào)表達(dá)。由此可知，基于高質(zhì)量的SNP標(biāo)記和高密度遺傳圖譜，棉花產(chǎn)量相關(guān)的基因信息逐漸得到挖掘。然而，由于產(chǎn)量相關(guān)性狀分子遺傳機(jī)制的復(fù)雜性，現(xiàn)有的研究成果仍然不夠充分，特別是對(duì)高穩(wěn)產(chǎn)品種產(chǎn)量相關(guān)基因的挖掘較少。

冀豐914是由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所培育的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)棉花品種，于2015年通過國(guó)家黃河流域棉區(qū)審定(國(guó)審棉2015003)，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、豐產(chǎn)性好等突出特點(diǎn)[19]。為進(jìn)一步探索高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)棉花產(chǎn)量性狀的分子遺傳機(jī)制，本研究以冀豐914為母本、優(yōu)質(zhì)自交系冀豐817為父本構(gòu)建F2和F3群體，基于GBS技術(shù)構(gòu)建的包含11 488個(gè)SNP標(biāo)記、總圖距4 202.12 cM的高密度遺傳圖譜，對(duì)單鈴質(zhì)量、衣分、子指和果枝數(shù)等性狀進(jìn)行QTL定位，并對(duì)重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行基因注釋及候選基因篩選，以期獲得更多產(chǎn)量相關(guān)的分子遺傳信息，為新品種選育及基因功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以自育國(guó)審品種冀豐914為母本，以優(yōu)質(zhì)自交系冀豐817(原系名：優(yōu)系817)為父本，于2018年在河北石家莊組配雜交組合，收獲F1種子，同年冬天在海南加代自交，收獲F2種子。于2019年在河北石家莊播種F2，行長(zhǎng)7.00 m，行距0.76 m，株距0.20 m，共15行、413個(gè)單株。于2020年在河北石家莊播種F3群體，行長(zhǎng)5.00 m，行距0.76 m，株距0.20 m，3次重復(fù)。同當(dāng)?shù)卮筇锕芾怼?/p>

9月底自然吐絮后，人工收獲F2群體單株全株棉鈴并計(jì)數(shù)，收獲F3群體株行20鈴，稱取籽棉質(zhì)量、計(jì)算單鈴質(zhì)量，軋花后稱取皮棉和子指質(zhì)量；收獲前調(diào)查果枝數(shù)；F3群體性狀數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)平均值。

1.2 GBS測(cè)序及遺傳圖譜構(gòu)建

在F2群體中隨機(jī)選取200個(gè)單株，采用CTAB法提取幼葉DNA[20]，經(jīng)質(zhì)檢后構(gòu)建文庫[21-22]，選擇MseⅠ和TaqαⅠ(Thermo scientific Fermentas)2種酶進(jìn)行酶切，回收397～420 bp長(zhǎng)度的酶切片段，通過Illumina HiSeqTM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。通過BWA (Burrows-Wheeler Aligner, version 0.7.17)軟件[23]對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組比對(duì)，通過GATK (Genome Analysis Tool-kit, version 4.0.11.0)軟件[24]檢測(cè)SNP標(biāo)記，通過MSTMap (Minimum spanning tree map, version update 2015)軟件[25]構(gòu)建遺傳圖譜。最終構(gòu)建一張包含11 488個(gè)SNP標(biāo)記、總圖距4 202.12 cM的遺傳圖譜，標(biāo)記間平均距離僅有0.37 cM。

1.3 分析方法

通過Excel 2016分析數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計(jì)量，通過SPSS 21.0分析性狀相關(guān)性。

通過QTLIciMapping 4.0軟件分析加性QTL[26-27]，分析參數(shù)為：Step=1 cM，PIN=0.001，LOD值由1 000次迭代計(jì)算確定。

基于陸地棉TM-1參考基因組[13]，注釋QTL位點(diǎn)內(nèi)的基因信息；通過KOBAS 3.0進(jìn)行基因的KEGG通路分析和GO富集分析[28]；根據(jù)陸地棉與海島棉的轉(zhuǎn)錄組信息[14]分析注釋基因表達(dá)量，篩選候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計(jì)量及簡(jiǎn)單相關(guān)性分析

表1為群體性狀基本統(tǒng)計(jì)量?？梢钥闯?，冀豐914的各性狀值均大于冀豐817。分離群體中，除2020年BW外，其他性狀呈現(xiàn)雙向超親分布，峰度和偏度的絕對(duì)值小于1，說明性狀呈正態(tài)分布，適合進(jìn)行QTL定位分析。由變異系數(shù)發(fā)現(xiàn)，子指的變異系數(shù)最大，果枝數(shù)的變異系數(shù)最小，F(xiàn)2群體性狀的變異系數(shù)大于F3群體。

表1 親本及群體產(chǎn)量性狀的基本統(tǒng)計(jì)量Tab.1 Basic statistics of the parents and population yield related traits

表2為4個(gè)性狀之間的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析結(jié)果?？梢钥闯?，子指與單鈴質(zhì)量之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，與衣分之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，實(shí)現(xiàn)棉花單鈴質(zhì)量、衣分和子指3個(gè)性狀的同步提高存在較大困難。果枝數(shù)與單鈴質(zhì)量、衣分、子指的相關(guān)性均不顯著，說明果枝的多少對(duì)單鈴質(zhì)量、衣分、子指3個(gè)性狀的影響較小。

表2 產(chǎn)量性狀之間的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis among the yield related traits

2.2 定位到50個(gè)產(chǎn)量相關(guān)的QTL位點(diǎn)

本研究共在22條染色體上定位到50個(gè)產(chǎn)量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，包括8個(gè)單鈴質(zhì)量QTL、20個(gè)衣分QTL、15個(gè)子指QTL和7個(gè)果枝數(shù)QTL(表3、圖1)。8個(gè)單鈴質(zhì)量QTL分布于8條染色體，單個(gè)QTL對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率為4.24%～9.79%，其中4個(gè)QTL的增效基因來源于冀豐914，包括qBW-A4-1、qBW-A5-1、qBW-A11-1和qBW-D10-1；qBW-A11-1可以同時(shí)在F2和F3群體中檢測(cè)到；qBW-A12-1的貢獻(xiàn)率為9.79%，增效基因來源于冀豐817。定位到20個(gè)衣分相關(guān)QTL，分布于14條染色體，其中A6、A13、D6、D10各分布有2個(gè)QTL，A7分布有3個(gè)QTL；單個(gè)QTL對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率為2.82%～12.52%；冀豐914為其中15個(gè)QTL提供增效基因；qLP-A6-1能夠在2個(gè)群體中檢測(cè)到，貢獻(xiàn)率分別為8.66%,4.72%，增效基因來源于冀豐914；qLP-A13-1的貢獻(xiàn)率達(dá)到12.52%，增效基因來源于冀豐914。定位到15個(gè)子指相關(guān)QTL，分布于13條染色體，A5和D3各有2個(gè)QTL；單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為3.21%～12.96%；7個(gè)QTL的增效基因來源于冀豐914，冀豐817為另外8個(gè)QTL提供增效基因；qSI-D3-1的貢獻(xiàn)率達(dá)到12.96%，增效基因來源于冀豐914。定位到7個(gè)果枝數(shù)QTL分布于5條染色體，D5分布有3個(gè)QTL；單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為4.00%～9.31%；冀豐914為其中2個(gè)QTL提供增效基因，冀豐817為另外5個(gè)QTL提供增效基因；qFBN-D10-1的貢獻(xiàn)率為9.31%，增效基因來源于冀豐914。

表3 產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL位點(diǎn)信息Tab.3 Detail information about yield related QTL

2.3 優(yōu)異QTL位點(diǎn)的基因注釋及功能分析

基于參考基因組的注釋信息，本研究對(duì)qBW-A11-1、qLP-A6-1、qLP-A13-1、qSI-D3-1和qSI-D3-2等5個(gè)穩(wěn)定或主效QTL進(jìn)行基因信息注釋。在qBW-A11-1內(nèi)注釋到15個(gè)基因，在qSI-D3-1內(nèi)注釋到26個(gè)基因，其他QTL未注釋到基因信息。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，注釋基因主要參與植物細(xì)胞壁形成、纖維素生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、TCA循環(huán)、代謝及氨基酸生物合成等條目。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，共有14個(gè)顯著富集的GO條目(P<0.01)，包括細(xì)胞膜組分、細(xì)胞壁合成、細(xì)胞分裂素響應(yīng)及多種酶活性等，共涉及10個(gè)基因；根據(jù)陸地棉TM-1和海島棉Hai 7124的轉(zhuǎn)錄組信息[14]，選擇根、莖、葉、花、不同發(fā)育時(shí)期的纖維和胚珠等組織，對(duì)這10個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有組織中，Ghir_A11G006820.1、Ghir_D03G004880.1、Ghir_D03G004930.1和Ghir_D03G004970.1的表達(dá)量均較低，Ghir_D03G005350.1的表達(dá)量均較高，Ghir_D03G005440.1在TM-1中的表達(dá)量高于Hai 7124(圖2)。

3 討論

產(chǎn)量是獲得效益的基礎(chǔ)，高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)是棉花育種及生產(chǎn)的主要目標(biāo)[1]。然而，由于植棉面積的減少，提高單產(chǎn)成為增加總產(chǎn)的重要保證，也是育種工作的重要挑戰(zhàn)。據(jù)研究，品種改良對(duì)棉花單產(chǎn)增加的貢獻(xiàn)率達(dá)到30%以上[29]，而分子技術(shù)在育種方法中的應(yīng)用將成為進(jìn)一步提高單產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1, 30]。因此，深入分析棉花產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的分子遺傳機(jī)制，挖掘有效的分子標(biāo)記及功能基因，是改良育種技術(shù)、提高育種效率、加快新品種培育的重要支撐[30]。本研究以高穩(wěn)產(chǎn)國(guó)審棉花品種冀豐914為母本，通過構(gòu)建F2和F3群體，結(jié)合高密度SNP遺傳圖譜，對(duì)產(chǎn)量相關(guān)的單鈴質(zhì)量、衣分、子指和果枝數(shù)等4個(gè)性狀進(jìn)行QTL定位及候選基因篩選，為進(jìn)一步改良棉花產(chǎn)量性狀奠定分子研究基礎(chǔ)。

QTL定位是挖掘數(shù)量性狀關(guān)鍵基因并進(jìn)行綜合性狀分析的經(jīng)典方法。Xie等[31]通過QTL定位，綜合分析了小麥灌漿過程決定粒質(zhì)量大小的關(guān)鍵因素；Zikhali等[32]在QTL定位基礎(chǔ)上，精細(xì)定位了一個(gè)控制小麥開花的關(guān)鍵基因；Pan等[33]對(duì)10個(gè)玉米重組自交系的株型性狀進(jìn)行QTL分析，為研究玉米株型的分子遺傳機(jī)制及理想株型育種奠定研究基礎(chǔ)。在棉花中，Zhu等[34-35]精細(xì)定位了棉花雞腳葉QTL，并得到關(guān)鍵候選基因GhOKRA；Xu等[36]通過經(jīng)典的精細(xì)定位方法，將纖維長(zhǎng)度QTLqFL-chr1縮小至0.9 cM區(qū)間內(nèi)；Chen等[37-38]基于QTL定位結(jié)果，結(jié)合測(cè)序技術(shù)，成功得到了棉花零式果枝性狀的關(guān)鍵基因；Ma等[39]在棉花株高相關(guān)QTL位點(diǎn)內(nèi)得到了一個(gè)GhPIN3基因；Feng等[40]通過回交，將纖維強(qiáng)度QTLqFS-Chr.D02精細(xì)定位于550.66 kb范圍內(nèi)，得到2個(gè)候選基因。在棉花產(chǎn)量方面，Su等[16]在A02染色體上關(guān)聯(lián)到一個(gè)衣分相關(guān)的候選基因Gh_A02G1268；Ma等[17]通過重測(cè)序技術(shù)，對(duì)產(chǎn)量相關(guān)的單鈴質(zhì)量、衣分、子指和衣指進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到Gh_D02G0025等候選基因；Sun等[3]分別在D03和D12染色體上關(guān)聯(lián)到一個(gè)產(chǎn)量相關(guān)的候選基因Gh_D03G1064和Gh_D12G2354；Song等[18]在D05染色體上關(guān)聯(lián)到2個(gè)衣分相關(guān)的候選基因Gh_D05G0313和Gh_D05G1124。本研究通過開展產(chǎn)量相關(guān)QTL定位，得到2個(gè)穩(wěn)定性較好的QTL(qBW-A11-1和qLP-A6-1)和3個(gè)貢獻(xiàn)率大于10%的QTL(qLP-A13-1、qSI-D3-1和qSI-D3-2)；基于參考基因組注釋信息，通過KEGG和GO分析，在qBW-A11-1和qSI-D3-12個(gè)QTL內(nèi)共注釋到41個(gè)參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁生物合成、氧化還原酶活性等功能的基因，其中，編碼肉桂酰輔酶A還原酶2類蛋白的Ghir_D03G005440.1基因位于qSI-D3-1區(qū)段內(nèi)，該基因在陸地棉TM-1多個(gè)組織中的表達(dá)量均高于Hai 7124。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂酰輔酶A還原酶是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[41-42]，木質(zhì)素是細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵物質(zhì)，在種子發(fā)育過程中有重要作用[43-44]。因此，Ghir_D03G005440.1基因可能對(duì)棉花種子發(fā)育及大小有重要影響。

本研究定位到的50個(gè)棉花產(chǎn)量性狀QTL中，56%(28/50)位點(diǎn)的增效基因來源于冀豐914，其中，75%衣分相關(guān)QTL(15/20)、2個(gè)穩(wěn)定QTL和3個(gè)主效QTL的增效基因均來源于冀豐914。由此說明，冀豐914對(duì)產(chǎn)量性狀有較強(qiáng)的遺傳控制，高衣分是其實(shí)現(xiàn)高穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。然而，由于本研究所用試驗(yàn)材料為F2和F3群體，研究結(jié)果需要通過高代穩(wěn)定群體結(jié)合多年多點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究通過對(duì)陸地棉產(chǎn)量性狀進(jìn)行QTL定位，獲得一個(gè)在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1中表達(dá)量較高的Ghir_D03G005440.1基因，該基因位于子指相關(guān)的QTL區(qū)段內(nèi)，可能參與棉花種子發(fā)育調(diào)控，為深入挖掘高穩(wěn)產(chǎn)棉花品種產(chǎn)量性狀的分子遺傳機(jī)制及關(guān)鍵基因提供了基礎(chǔ)；初步表明高衣分是冀豐914實(shí)現(xiàn)高穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。