銀杏葉聚戊烯醇金屬配合物的合成及其光控活性

張昌偉， 陶 冉， 齊志文， 沈 紅， 薛興穎， 王成章*

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局 林產(chǎn)化學工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源和材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

銀杏是我國寶貴且特有的林源植物，銀杏葉具有多方面重要的藥理作用和經(jīng)濟價值，其主要的生物活性成分為黃酮、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇(PPs)和多糖等[1]。我國銀杏葉產(chǎn)品的開發(fā)應用仍處于初始階段，主要利用其中的黃酮和萜內(nèi)酯成分，最有價值的PPs尚未開發(fā)利用。銀杏葉聚戊烯醇(GBP)是由14～24個異戊烯基單元構(gòu)成的樺木萜醇類PPs，由于其類似參與人體糖蛋白合成多萜醇的結(jié)構(gòu)而成為了近年來的研究熱點[2-4]。目前，關(guān)于GBP生物活性的研究主要集中在抗腫瘤、抑菌和抗氧化方面。王成章等[5]以GBP為原料進行抗腫瘤實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對A549、Hips、S180、EC和Heps等多種腫瘤細胞均具有顯著的抑制活性。Zhang等[6-7]對GBP的抑菌和抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和肺炎鏈球菌均具有強烈的抑制效果，并且對ABTS、DPPH、羥基自由基和超氧陰離子均具有較好的清除作用。GBP較好的生物活性使其在藥品、保健品和化妝品等功能性產(chǎn)品領(lǐng)域極具開發(fā)潛力。但是，由于GBP本身相對分子質(zhì)量大和疏水性強導致的低生物利用度，以及缺乏可控釋放性造成的正常組織毒副性，限制了其相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)和應用。研究者們主要是通過物理或者化學手段來改善GBP的親水親脂性，從而提高其生物利用度[8-10]，但仍然無法解決其可控釋放性問題。釕(Ru)多吡啶配合物因具有豐富可調(diào)的親水親脂性、協(xié)同增效以及時間和空間上的可控釋放性等優(yōu)勢，在解決GBP功能性產(chǎn)品開發(fā)應用問題方面極具發(fā)展前景[11-13]。傳統(tǒng)的釕多吡啶配合物主要由主配體和無生物活性的功能配體組成。近年來，通過引入生物活性分子作為可解離功能配體，在光照射后同時釋放具有交聯(lián)生物分子功能的釕雙水合物和生物活性分子，以達到協(xié)同增效的目的，是釕多吡啶配合物發(fā)展的一大趨勢。Sgambellone等[14]在釕多吡啶配合物上引入蛋白酶抑制劑或小分子化療藥物作為可解離的功能配體，在光照下實現(xiàn)了協(xié)同增效的目的。GBP本身較好的生物活性使其具有成為釕多吡啶配合物功能配體的潛力。但是，目前關(guān)于GBP-釕多吡啶配合物合成方面的研究在國內(nèi)外鮮見報道。因此，本研究以GBP為原料合成GBP-釕多吡啶配合物，并綜合考察其脂水分配系數(shù)、光致配體解離能力和光控抗腫瘤活性，以期為GBP功能性產(chǎn)品的高值化開發(fā)和應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聚戊烯醇標準品(99.8%)，購自瑞典Larodan Fine Chemicals Co., Ltd.；人體肺癌細胞A549，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基、發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒、基因組全提取試劑盒、硅膠(45～75 μm)，均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；三乙胺(TEA)、四氫呋喃(THF)、甲基磺酰氯(MsCl)、順-二(2，2′-聯(lián)吡啶)二氯化釕、2,2′-聯(lián)吡啶、氯化鋰、N,N-二甲基甲酰胺、無水丙酮、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、六氟磷酸銨、乙腈、氰化鈉(NaCN)、無水硫酸鈉等，均為市售分析純。

HAD-FD-CNMR-I核磁共振儀，北京恒奧德儀器儀表有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；TECAN M1000酶標儀，北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 氰基聚戊烯醇的合成

稱取1.00 g聚戊烯醇和0.55 g的TEA放入20 mL的THF中，然后在0 ℃條件下逐滴加入0.62 g的MsCl，得到的混合物在0 ℃條件下攪拌1 h。經(jīng)層析劑石油醚/乙酸乙酯(體積比10 ∶1)、產(chǎn)物比移值為0.55的薄層色譜(TLC)顯示聚戊烯醇被完全消耗，并且形成許多新斑點。將混合物進行水洗、濃縮，得到的1.35 g中間產(chǎn)物(如圖1所示結(jié)構(gòu))溶解在THF中。

圖1 氰基聚戊烯醇合成路線

將含有1.35 g中間產(chǎn)物的THF溶液和0.68 g的TEA加入20 mL的THF中，然后在0 ℃條件下逐滴加入0.41 g的NaCN，得到的混合物在20 ℃下攪拌3 h。經(jīng)層析劑石油醚/乙酸乙酯(體積比10 ∶1)、產(chǎn)物的比移值為0.65的薄層色譜(TLC)顯示反應物完全反應。向反應后的混合物中依次倒入20 mL水和30 mL乙酸乙酯；合并的有機層用20 mL飽和氯化鈉溶液洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥、過濾并減壓濃縮，得到黃色油狀液體；黃色油狀液體通過硅膠柱色譜(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯，體積比10 ∶1)進行純化，得到的0.50 g化合物為黃色油狀液體，即為氰基聚戊烯醇。

1.3 聚戊烯醇-釕多吡啶配合物的合成

稱取42 mg氰基聚戊烯醇和12.6 mg氫氧化鉀置于12 mL 水/乙醇(體積比1 ∶3)的混合溶液中，采用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器攪拌30 min后，加入100 mg順-二(2,2′-聯(lián)吡啶)二氯化釕(cis-Ru(bpy)2Cl2)，回流2 h，旋蒸除去溶劑，得到濃縮物0.05 g。稱取1.5 g硅膠(45～75 μm)裝入硅膠柱(1 cm×30 cm)，將濃縮物用少量乙醇溶解后加入硅膠柱中，用50 mL三氯甲烷/乙醇(體積比100 ∶4)進行洗脫(流速2.5 mL/min)分離。收集的化合物溶于乙醇，加入NH4PF6后產(chǎn)生固體沉淀，用濾紙過濾，收集紅色沉淀，再用水洗滌，干燥，即得聚戊烯醇-釕多吡啶配合物(如圖2所示)。

R1=聚戊烯醇polyprenols圖2 聚戊烯醇-釕多吡啶配合物Fig.2 Polyprenols-ruthenium polypyridine complex

1.4 樣品表征及性能分析

1.4.1NMR分析 將氰基聚戊烯醇用CDCl3溶解，然后進行1H NMR和13C NMR分析。將聚戊烯醇-釕多吡啶配合物用CD4O溶解，然后進行1H NMR和13C NMR分析。

1.4.2脂水分配系數(shù)測定 脂水分配系數(shù)是指化合物在水相和脂相的溶解分配率，通過測定該系數(shù)可以反映化合物穿透細胞膜的能力。分別取聚戊烯醇(10.6 mg/L)和聚戊烯醇-釕多吡啶配合物(24.8 mg/L)的1 mL水溶液，加入1 mL正辛醇，超聲波(功率100 W)處理30 min使其在兩相間平衡。離心后，用紫外吸收光譜測定配合物在兩相中的濃度。根據(jù)公式(1)計算脂水分配系數(shù)，最終結(jié)果取3次測定平均值。

P=C0/Cw

(1)

式中：C0—配合物在正辛醇相中的質(zhì)量濃度，g/L；Cw—配合物在水相中的質(zhì)量濃度，g/L。

1.4.3光致配體解離實驗 首先將配合物溶液放置在黑暗條件下24 h，測定配合物溶液放置前后的紫外吸收光譜變化。然后將配合物放置在波長大于450 nm的可見光下照射90 min，每隔6 min測定配合物的紫外吸收光譜，根據(jù)其紫外吸收光譜隨光照時間的變化情況分析其是否具有光致配體解離能力。光致配體解離實驗所用光源為太陽能模擬器，用470 nm濾光片截掉短波光。

1.4.4細胞毒性實驗 人體肺癌細胞A549在含有10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%。A549細胞按每孔2×105個種在96孔板中，生長24 h。加入含有不同聚戊烯醇-釕多吡啶配合物濃度(0.78、 1.56、 3.13、 6.25、 12.5、 25、 50、 100、 200 μmol/L)培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，用15 W LED燈(470 nm)光照30 min，以未進行光照的聚戊烯醇作為對照組。再將細胞培養(yǎng)48 h后，加入發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒測定細胞存活率。用多功能酶標儀檢測最終發(fā)光，配合物的細胞抑制率計算公式如下：

(2)

式中：y—細胞抑制率，%；A1—實驗組吸光度；A2—對照組吸光度；A0—空白組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氰基聚戊烯醇表征結(jié)果

圖3 氰基聚戊烯醇的氫譜(a)和碳譜(b)圖

2.2 聚戊烯醇-釕多吡啶配合物的表征結(jié)果

圖4 聚戊烯醇金屬配合物的的氫譜(a)和碳譜(b)圖

2.3 聚戊烯醇-釕多吡啶配合物的性能分析

聚戊烯醇-釕多吡啶配合物的性能主要包括脂水分配系數(shù)、光/暗穩(wěn)定性和光致配體解離能力。脂水分配系數(shù)在0～3的范圍內(nèi)親水親脂性最優(yōu)，最適于穿透細胞膜。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，聚戊烯醇和聚戊烯醇金屬配合物的脂水分配系數(shù)分別為5.86和1.35。聚戊烯醇為強疏水性化合物，很難透過細胞膜，經(jīng)過改性后得到的配合物親水性增強，有利于其穿透細胞膜，更易于被細胞吸收利用。一個理想的光敏劑應該具有很好的暗穩(wěn)定性，聚戊烯醇金屬配合物溶液在黑暗條件下放置24 h前后的吸收光譜，如圖5(a)所示。由圖可知，聚戊烯醇金屬配合物的吸收光譜在放置24 h之后幾乎沒發(fā)生變化，由此表明聚戊烯醇金屬配合物具有較好的暗穩(wěn)定性。但在可見光(波長≥470 nm)的照射下，聚戊烯醇金屬配合物的吸收光譜隨光照時間延長表現(xiàn)出如圖5(b)所示規(guī)律性變化。聚戊烯醇金屬配合物在480 nm處出現(xiàn)明顯的等吸收點，表明有新產(chǎn)物生成。隨著光照的進行，聚戊烯醇金屬配合物逐漸發(fā)生配體解離，當光照到90 min后配合物的最大吸收峰紅移到490 nm，是典型的Ru(Ⅱ)(bpy)雙水合物[Ru(bpy)2(H2O)2]2+的特征吸收峰[15]，表明氰基聚戊烯醇配體發(fā)生了解離。

2.4 聚戊烯醇金屬配合物的光控抗腫瘤活性

圖6為聚戊烯醇金屬配合物濃度與A549腫瘤細胞抑制率之間的關(guān)系。

圖5 聚戊烯醇金屬配合物在黑暗(a)和光照(b)條件下的紫外吸收光譜變化

1.DNA; 2.5 μmol/L; 3.10 μmol/L; 4.20 μmol/L圖7 不同濃度配合物與DNA作用后的電泳圖Fig.7 Gel electrophoresis image of complexes with different concn. after being interacted with DNA

由圖6可知，隨著配合物濃度的增加，其對腫瘤細胞的抑制率先是急劇增加然后增加變緩。經(jīng)過分析可知，聚戊烯醇和聚戊烯醇金屬配合物對A549腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為45.8和29.3 μmol/L，說明聚戊烯醇和聚戊烯醇金屬配合物均具有較好的A549腫瘤細胞抑制活性。此外，配合物展示出更好的抗A549腫瘤細胞活性，說明配合物在光致解離的同時釋放聚戊烯醇和釕多吡啶配合物，這兩者可起到協(xié)同抗腫瘤的效果。在此基礎(chǔ)上，利用基因組全提取試劑盒對A549腫瘤細胞的DNA進行了提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳實驗研究了不同濃度聚戊烯醇金屬配合物與該DNA之間的相互作用，結(jié)果如圖7所示，條帶1對應的是A549腫瘤細胞DNA，條帶2、 3、 4分別對應的是5、 10、 20 μmol/L 的配合物。由圖7可以明顯的看出條帶1跑到了條帶2的前面，因此可以判斷低濃度配合物共價結(jié)合DNA后，導致DNA遷移速率減慢(條帶2)。而在高濃度下，DNA發(fā)生單鏈斷裂，導致條帶形狀發(fā)生了改變(條帶3和條帶4)。因此，推斷聚戊烯醇金屬配合物的A549腫瘤細胞抑制活性極有可能與其DNA結(jié)合能力有關(guān)。

3 結(jié) 論

以銀杏葉聚戊烯醇為原料，成功合成了氰基聚戊烯醇和聚戊烯醇-釕多吡啶配合物。合成的配合物具有較好的脂水分配系數(shù)(1.35)，有利于其穿透細胞膜。此外，合成的配合物展示出較好的光致配體解離能力和光控抗腫瘤活性，其對A549腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)29.3 μmol/L。并且，聚戊烯醇金屬配合物的光控抗腫瘤活性極有可能與其DNA結(jié)合能力有關(guān)。實驗的研究結(jié)果對于解決銀杏葉聚戊烯醇的生物利用度和可控釋放問題具有重要的參考意義，同時也可為其功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考和技術(shù)支撐。