陳吉圣 席世改 秦傳新,2① 郭 禹,2 潘莞倪 邵廣彧

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院海洋牧場(chǎng)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510300;2. 國(guó)家漁業(yè)資源環(huán)境大鵬觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 深圳 518121; 3. 江蘇海洋大學(xué) 連云港 222000)

紫海膽(Anthocidaris crassi spina)是一種名貴的海珍品，在浙、閩、臺(tái)、粵、瓊等省的沿海海域均有廣泛分布，其性腺味道鮮美，且富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(席世改等, 2020)，性腺提取物“波利乃寧”(Bonellinin)能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，可作為抗癌藥物的材料(廖承義, 1985)。近年來(lái)，隨著野生紫海膽被過(guò)度捕撈，野生資源日漸枯竭，養(yǎng)殖海膽逐漸成為海膽性腺攝取及食用的主要來(lái)源，對(duì)人工養(yǎng)殖技術(shù)需求越來(lái)越高。20 世紀(jì)以來(lái)，許多學(xué)者在紫海膽人工育苗、攝食習(xí)性及呼吸代謝等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究(楊章武等, 2001; 馮雪等, 2012; 聶永康等,2016; 莫寶霖等, 2017; 席世改等, 2020)。

光照強(qiáng)度(即單位面積上所接受可見光的光通量，單位為lx)作為水生生物生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子，它直接或間接影響著水生生物的棲息選擇、生長(zhǎng)發(fā)育、攝食、繁殖、晝夜活動(dòng)節(jié)律等生理活動(dòng)(周顯青等, 2000; 孫德文等, 2003; 王想等, 2020)。相關(guān)學(xué)者在光照強(qiáng)度對(duì)水生生物生長(zhǎng)及存活、攝食等方面的影響進(jìn)行了研究。薛素燕等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光照組刺參幼參的生長(zhǎng)明顯快于暗光照組；郭文學(xué)等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，哲羅魚(Hucho ta imen)存活率、體長(zhǎng)、體質(zhì)量及特定生長(zhǎng)率參數(shù)均隨光照強(qiáng)度的增加而增加；光照周期對(duì)大菱鲆(Scophthatmus maximus)幼魚和尖吻鱸(Lates calcarifer)仔稚魚的攝食、消化酶活力均有顯著影響(周勝杰等, 2018; 李寶山等, 2019)；楊軍等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度影響光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)的聚集率，并驗(yàn)證了光棘球海膽的避光特性。為提高海膽人工養(yǎng)殖技術(shù)，對(duì)不同光照條件下海膽幼體的生長(zhǎng)特性研究至關(guān)重要。因此，本研究運(yùn)用模擬自然光周期的方法，探究不同光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體不同發(fā)育階段的生長(zhǎng)、存活以及體內(nèi)消化酶活性的影響，不僅可以豐富棘皮動(dòng)物的生理生態(tài)學(xué)理論，也可為紫海膽的人工養(yǎng)殖技術(shù)的提高提供實(shí)踐指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 浮游幼體的培育

實(shí)驗(yàn)用紫海膽親體采自福建省廈門附近海域，航空運(yùn)輸至中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所三亞熱帶水產(chǎn)研究院。紫海膽親體經(jīng)過(guò)陰干運(yùn)輸，移入育苗水泥池中，采用流水刺激的方法，使其自然產(chǎn)卵、受精。受精卵經(jīng)38 h 發(fā)育，于兩腕浮游幼體期，用200 目和400 目(200 目過(guò)濾雜質(zhì)，400 目收集幼體)篩絹網(wǎng)濾出、清洗，再移至育苗水泥池中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為0.04 個(gè)/ml。

浮游幼體培育期間，每日換水50%，08:30 和17:30 投喂纖細(xì)角毛藻(Chaetoceros gracilis)和叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)的等比例混合藻液。每次投喂1×104～7×104個(gè)/ml 混合藻液2 L。浮游幼體培育期間水體體積為450 L，水溫(29.5±0.5)℃、pH 8.0±0.1、鹽度31.4±0.9。藻類均取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所三亞熱帶水產(chǎn)研究院藻種室，采用f/2 培養(yǎng)液自然光照培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)全程保持每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶的水溫、pH 和鹽度的相對(duì)恒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)置的光照強(qiáng)度為0(全黑暗)、500、1000、2000 和3000 lx，每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，測(cè)定光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體體長(zhǎng)生長(zhǎng)和消化酶活性的影響。養(yǎng)殖容器為760 L 的PVC 水桶。實(shí)驗(yàn)中每組的光照強(qiáng)度通過(guò)更換每個(gè)水桶上方的燈泡功率及調(diào)整光源距離來(lái)實(shí)現(xiàn)，并用照度計(jì)(Lx meter AR813A)于水面上方3 cm 處測(cè)定光照強(qiáng)度。為避免自然光與實(shí)驗(yàn)組光源的干擾，每個(gè)水桶上方均覆蓋黑色遮光布，期間采用12 L : 12 D(08:00～20:00)光照周期，全黑暗處理每天總計(jì)約有30 min 暴露在光照下進(jìn)行投喂、換水、吸底等日常操作。

實(shí)驗(yàn)自紫海膽兩腕浮游幼體期即2 日齡開始，至18 日齡變態(tài)期結(jié)束。根據(jù)其發(fā)育階段分別于實(shí)驗(yàn)的8 d(四腕幼體)、11 d(六腕幼體)、16 d(八腕幼體)取樣(混勻培育水體，隨機(jī)多點(diǎn)取樣)并保存于-80℃冰箱。

光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體體長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)使用Toup View 圖像分析軟件進(jìn)行拍照并測(cè)量大小，具體為各實(shí)驗(yàn)組紫海膽浮游幼體樣品的體長(zhǎng)、軀干部骨針長(zhǎng)度和口后腕骨針長(zhǎng)度。

光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游消化酶活性的影響實(shí)驗(yàn)采用可見分光光度法，用酶標(biāo)儀(WD-2012B，北京六一生物科技有限公司)測(cè)量各樣品消化酶的活性。淀粉酶活性采用北京雷根生物淀粉酶(Amylase)檢測(cè)試劑盒，胃蛋白酶活性采用北京索萊寶胃蛋白酶(Pepsin)試劑盒，脂肪酶活性用索橋生物脂肪酶(Lipase)測(cè)試盒，具體步驟均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2010 和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，所有數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05 為差異顯著。采用Origin 8.1 繪制紫海膽浮游幼體體長(zhǎng)變化和消化酶活性變化圖。

2 結(jié)果

2.1 不同光照強(qiáng)度下浮游幼體的生長(zhǎng)率

紫海膽浮游幼體的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)見圖1，光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體的體長(zhǎng)、軀干部骨針長(zhǎng)度和口后腕骨針長(zhǎng)度的影響表現(xiàn)一致。趨勢(shì)由高到低為500 lx＞全黑暗＞1000 lx＞2000 lx＞3000 lx。在500 lx 條件下，紫海膽浮游幼體的體長(zhǎng)、軀干部骨針長(zhǎng)度和口后腕骨針長(zhǎng)度都達(dá)到最高，生長(zhǎng)最快且顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。而在3000 lx 條件下，紫海膽浮游幼體發(fā)育到11 d 于四腕幼體期停止生長(zhǎng)，全部死亡。

2.2 不同光照強(qiáng)度下浮游幼體的消化酶活性

紫海膽浮游幼體的脂肪酶活性見圖2，紫海膽四腕幼體階段的脂肪酶活性隨著光照強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。在光照強(qiáng)度為1000 lx 時(shí)，脂肪酶活性最低。光照強(qiáng)度500 lx 時(shí)，脂肪酶活性最強(qiáng)，但與其他實(shí)驗(yàn)組差異不顯著(P＞0.05)。紫海膽六腕幼體階段的脂肪酶活性活性差別較小，光照強(qiáng)度為1000 lx 時(shí)，脂肪酶活性最低，與其他實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P＜0.05)。紫海膽八腕幼體階段的脂肪酶活性隨光照強(qiáng)度增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。光照強(qiáng)度500 lx時(shí)，脂肪酶活性最強(qiáng)，與其他實(shí)驗(yàn)組相比差異顯著(P＜0.05)。

圖1 不同光照強(qiáng)度下浮游幼體體長(zhǎng)(a)、軀干部骨針長(zhǎng)度(b)和口后腕骨針長(zhǎng)度(c)Fig.1 Effects of light intensity on larval length (a), body-rod length (b), and post-oral arm length (c) of sea urchin larvae

圖2 光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體脂肪酶活性的影響Fig.2 Effects of light intensity on lipase activity of sea urchin larvae

紫海膽浮游幼體的淀粉酶活性見圖3，該階段淀粉酶活性隨光照強(qiáng)度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。在光照強(qiáng)度為500 lx 時(shí)，淀粉酶活性最強(qiáng)，與其他實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P＜0.05)。光照強(qiáng)度為3000 lx 時(shí)，淀粉酶活性最低，與其他實(shí)驗(yàn)組相比差異顯著(P＜0.05)。

紫海膽浮游幼體的胃蛋白酶活性如圖4 所示。紫海膽六腕階段光照強(qiáng)度對(duì)胃蛋白酶活性的影響較大，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)呈先下降后上升的趨勢(shì)。在光照強(qiáng)度為2000 lx 時(shí)，紫海膽六腕階段的胃蛋白酶活性最強(qiáng)，與其他實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著(P＜0.05)。在光照強(qiáng)度為3000 lx 時(shí)，胃蛋白酶活性最低，與其他實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著(P＜0.05)。

圖3 光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體淀粉酶活性的影響Fig.3 Effects of light intensity on amylase activity of sea urchin larvae

圖4 光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體胃蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of light intensity on pepsin activity of sea urchin larvae

3 討論

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體存活的影響

光照強(qiáng)度對(duì)水生生物生長(zhǎng)的影響因種類不同而存在顯著差異。瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachell i)適合在光照強(qiáng)度為0～10 lx 的環(huán)境下生活(白艷勤等, 2014)。九孔鮑(Haliotis d iversicolor aquatilis)幼鮑最適宜的光照強(qiáng)度為700～1000 lx (嚴(yán)正凜等, 2001)。大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)的生長(zhǎng)速度在強(qiáng)光下高于在弱光下。北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinus alpinus)幼體生長(zhǎng)速度在 50 lx 的光照強(qiáng)度下最快，死亡率最低(Minagawa, 1994)。刺參(Apostichopus japonicus)幼體生長(zhǎng)速度隨著光照強(qiáng)度的增加而減慢，在光照強(qiáng)度為50 lx 的光照環(huán)境下，生長(zhǎng)速度最快(張鵬等, 2013)。參考光照強(qiáng)度對(duì)刺參行為特性的影響(張碩等, 2006)及海參大多選擇光強(qiáng)強(qiáng)度較低的區(qū)域棲息(常亞青等,2004)等信息，紫海膽浮游幼體通過(guò)調(diào)整晝夜活動(dòng)節(jié)律來(lái)尋找較弱光照強(qiáng)度更適合其生長(zhǎng)發(fā)育。經(jīng)此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體的生長(zhǎng)發(fā)育影響顯著，在500 lx 光照環(huán)境下生長(zhǎng)最快且存活率最高，全黑暗次之；在3000 lx 下生長(zhǎng)最慢且存活率最低，在發(fā)育至11 d 時(shí)全部死亡。光照可直接或間接影響同為棘皮動(dòng)物刺參幼參的攝食等生理活動(dòng)(魏子仲等,2014)，分析認(rèn)為，3000 lx 光照強(qiáng)度代表自然生長(zhǎng)環(huán)境中陽(yáng)光輻射過(guò)強(qiáng)或過(guò)于靠近水體表層，超過(guò)了紫海膽浮游幼體承受的臨界值，使其攝食效率下降，不能積蓄充足能量繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，最終死亡，導(dǎo)致存活率下降，而光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體攝食效率的影響也有待繼續(xù)探究。

3.2 光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體消化酶活性的影響

消化酶的主要功能是消化和分解生物從外界攝取的食物，為個(gè)體提供生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和晝夜活動(dòng)等所需的能量，其活力的大小能夠反映水產(chǎn)生物消化生理的基本特征，環(huán)境因子的變化會(huì)導(dǎo)致身體失去更多的能量，這在一定程度上就需要消化酶更活躍地消化食物，以保證能量的正常供應(yīng)(任曉偉, 2008)。目前，主要的研究方向?yàn)轱暳现舅?、不同蛋白源、環(huán)境因子(溫度、pH 等)對(duì)消化酶的影響(李俊輝等, 2011;侯受權(quán)等, 2016; 左然濤等, 2017)。

光照是水生生物生長(zhǎng)的重要的環(huán)境因子，光照強(qiáng)度對(duì)水生生物生理活動(dòng)的影響體現(xiàn)在多方面(周顯青等, 2000)。王芳等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，完全黑暗下，中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus ch inensis)稚蝦的蛋白酶活力最強(qiáng)。魏子仲等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，在2000 lx 光照強(qiáng)度下，刺參幼參的消化酶和脂肪酶活性最強(qiáng)；1000 lx光照強(qiáng)度下蛋白酶活性最強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，在光照強(qiáng)度為500 lx 時(shí)，紫海膽浮游幼體的脂肪酶和淀粉酶活性最強(qiáng)，在光照強(qiáng)度為2000 lx 時(shí)，胃蛋白酶活性最強(qiáng)，可見不同消化酶對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)存在差異，且光照強(qiáng)度的增加在一定程度上促進(jìn)了消化酶活性。光照強(qiáng)度的變化改變了紫海膽浮游幼體的3 種消化酶活性，并最終導(dǎo)致其存活率的改變。

3.3 光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體不同階段的消化酶活性的影響

研究表明，生物在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的消化酶活性也有所不同。隨著大黃魚(Pseudosciaena crocea)的發(fā)育，其體內(nèi)的蛋白酶活性呈逐漸降低趨勢(shì)，而脂肪酶和淀粉酶活力呈上升趨勢(shì)(席峰等, 2003)。隨著牙鲆(Paralichthys olivaceus)的發(fā)育，其體內(nèi)的蛋白酶、脂肪酶活性逐漸增強(qiáng)，而淀粉酶活性呈下降趨勢(shì)(王宏田等, 2002)。隨著刺參從幼體發(fā)育到稚參，體內(nèi)的蛋白酶和淀粉酶活力呈上升趨勢(shì)，而褐藻酸酶的活性呈下降趨勢(shì)(唐黎等, 2007)。本研究中，紫海膽不同發(fā)育階段幼體的各種消化酶活性也有所不同，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，脂肪酶和淀粉酶活性在八腕幼體階段有所下降，而胃蛋白酶活性有所上升，分析認(rèn)為，與其生活方式轉(zhuǎn)變和食性變化有關(guān)，這期間由浮游生活轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞街睿承砸灿筛∮紊镏饾u過(guò)渡到底棲硅藻及有機(jī)碎屑，食譜中逐漸出現(xiàn)動(dòng)物性蛋白，由此表現(xiàn)在其消化酶中胃蛋白酶的活性逐漸優(yōu)于其他2種消化酶。

4 結(jié)論

本研究表明，紫海膽浮游幼體在弱光環(huán)境的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程明顯優(yōu)于強(qiáng)光環(huán)境，光照強(qiáng)度為500 lx 時(shí)，生長(zhǎng)率最佳且能保持良好存活率；光照強(qiáng)度為3000 lx時(shí)生長(zhǎng)最慢且死亡率最高。特定光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽浮游幼體不同消化酶的影響不同，光照強(qiáng)度為500 lx時(shí)，脂肪酶、淀粉酶活性最強(qiáng)；光照強(qiáng)度為2000 lx時(shí)，胃蛋白酶活性最強(qiáng)；光照強(qiáng)度為1000 lx 時(shí)，脂肪酶活性最低；光照強(qiáng)度為3000 lx 時(shí)，淀粉酶、胃蛋白酶活性最低。綜上可知，高光照強(qiáng)度降低了紫海膽浮游幼體的生長(zhǎng)率、存活率及消化酶的活性，是紫海膽浮游幼體生長(zhǎng)發(fā)育的不利因素。在本實(shí)驗(yàn)條件下，500 lx 的光照強(qiáng)度下，紫海膽浮游幼體有最高生長(zhǎng)率且存活率良好，總消化酶活性最強(qiáng)且各消化酶活性最均衡，是其生長(zhǎng)發(fā)育的最佳光照強(qiáng)度，結(jié)合紫海膽浮游幼體的發(fā)育階段，在日常生產(chǎn)管理中，或可通過(guò)控制光照強(qiáng)度來(lái)提高紫海膽的生長(zhǎng)發(fā)育效果。目前，光照強(qiáng)度對(duì)紫海膽幼體生長(zhǎng)發(fā)育影響的相關(guān)內(nèi)容尚不完善，未來(lái)可細(xì)化弱光照強(qiáng)度梯度探討最適宜其生長(zhǎng)的弱光環(huán)境，對(duì)此方面的研究?jī)?nèi)容做出補(bǔ)充，既能豐富該方面的生理生態(tài)學(xué)知識(shí)，也能繼續(xù)為紫海膽的人工增養(yǎng)殖提供科學(xué)指導(dǎo)和依據(jù)。