曾德華,吳志祥，趙懷寶，劉 俊，寇旭陽，張 源

(1．三亞市林業(yè)科學(xué)研究院，海南 三亞572022；2.海南熱帶海洋學(xué)院a.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.生態(tài)環(huán)境學(xué)院，海南 三亞 572000)

0 引言

紅樹林是熱帶、亞熱帶海灣、河口泥灘上特有的常綠灌木和小喬木群落；它生長于陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，是陸地向海洋過渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)。紅樹林不單是部分海洋生物的棲息地，還具有防浪護(hù)堤、納污及凈化等生態(tài)功能，具有較高的工業(yè)、藥用及旅游開發(fā)價值。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)具有高生產(chǎn)力，高歸還率和高分解率的“三高”特點(diǎn)，其中的微生物發(fā)揮著重要作用。紅樹林底質(zhì)中存在的微生物資源，不僅具有陸源微生物的基本特征，而且通常具有降解或轉(zhuǎn)化有機(jī)污染物的巨大潛力，在物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[1]249,[2]562。

近年來，紅樹林生態(tài)環(huán)境中的微生物資源引起了科學(xué)家的高度關(guān)注，對來自世界各地區(qū)紅樹林環(huán)境的微生物進(jìn)行了研究。Sengupta和Chaudhuri[2]562從不同紅樹林沉積物和根系中分離得到Azospirillum、Azotobacter、Rhizobium、Clostridium和Klebsiella等固氮菌。Holguin等[3]257研究了紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中參與營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的微生物，發(fā)現(xiàn)固氮菌、溶磷菌和真菌較多。印度學(xué)者Ananda等[4]872研究了西海岸紅樹根際內(nèi)生真菌的多樣性。Jalal等[5]640從馬來西亞紅樹林沉積物中分離到多種細(xì)菌，如Chromobacteriumviolaceum、Pseudomonasaeruginosa、Serratiarubudaea、Klebsiellapnuemoniae等。Baskaran等[6]28從印度安達(dá)曼紅樹林沉積物中分離到42株放線菌，其中大部分為鏈霉菌屬。楊曉洪等[7]99,[8]118在八門灣紅樹林分離到23個細(xì)菌類群、22個古菌類群、15個真菌類群，12個放線菌類群。高兆明[9]36研究發(fā)現(xiàn)紅樹林地區(qū)絕大多數(shù)真菌都能產(chǎn)生木質(zhì)纖維素酶。戴旭青[10]36研究發(fā)現(xiàn)78株具有降解纖維素能力的菌株，大部分為真菌，放線菌次之，細(xì)菌最少。謝為天等[11]157在紅樹林中篩選出一株名為解淀粉芽孢桿菌的菌株，具有產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶的能力，其酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。趙艷娟[12]107采用18種放線菌培養(yǎng)基在北海紅樹林根際土壤中分離出42株放線菌，其中一株鏈霉菌屬菌株有淀粉酶活性、無纖維素酶活性。姚琦等[13]859研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落多樣性隨著月份變化有著顯著的變化，突出表現(xiàn)在12月份土壤微生物群落有較強(qiáng)的活性，但2月份土壤微生物具有物種多且分布均勻的特征。麥國琴等[14]180從深圳福田紅樹林土壤中分離了80株真菌，經(jīng)過產(chǎn)酶發(fā)酵復(fù)篩，獲得2株同時具有較高木聚糖酶和纖維素酶活的真菌。其中一菌株木聚糖酶和纖維素酶的酶活分別為39.01 IU 和 0.87 IU。馮玲玲等[15]1357在研究海南三亞紅樹林底泥中放線菌多樣性和抗菌活性，共分離到149株放線菌，隸屬6個目12個科16個屬，其中小單抱菌屬為優(yōu)勢屬；其中20株放線菌具有抗菌活性，82株放線菌含有生物合成基因，表明海南三亞紅樹林含有豐富的藥用放線菌資源，具有從中發(fā)現(xiàn)新穎活性物質(zhì)的潛力。馬軍等[16]999從紅樹林根際土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的革蘭氏陽性菌，經(jīng)分析鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。曾思泉等[17]39利用水解圈法從三亞紅沙河紅樹林區(qū)分離得到1株纖維素降解真菌 SCSIO 43503。經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定并綜合形態(tài)學(xué)特征，推測其為枝孢屬(Gladaxporism) 真菌。

三亞河紅樹林物種豐富、古老，得天獨(dú)厚的條件也孕育了豐富的微生物資源。隨著城市快速發(fā)展，特別是排污等影響，其生境也不同程度受到了影響。研究和開發(fā)紅樹林沉積物中的微生物，不僅有助于理解生態(tài)學(xué)過程，而且可應(yīng)用于紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的監(jiān)測、管理及恢復(fù)。從三亞河紅樹林底質(zhì)中篩選出具有降解纖維素能力的菌株，進(jìn)行分離、純化，對其形態(tài)學(xué)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)做初步鑒定，進(jìn)行酶的活性研究，為后續(xù)開發(fā)利用做準(zhǔn)備。

1 研究方法與材料

1.1 采樣地點(diǎn)設(shè)置

三亞河紅樹林自然保護(hù)區(qū)位于18°19′～18°37′N，108° 36′～109°46′E。在三亞河沿岸紅樹林中根據(jù)不同群落、不同的河道區(qū)段，選取7個樣地進(jìn)行采樣。

1.2 取樣

在每一樣地，采用五點(diǎn)法對每一個樣品進(jìn)行取樣。在每個點(diǎn)取0～5 cm，5～10 cm，10～15 cm，15～20 cm，25～30 cm的土壤若干，將各個點(diǎn)的同一深度土樣混合，并做標(biāo)記，待用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

(1) 羧甲基纖維素鈉平板分離培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉10.0 g 、蛋白胨10.0 g 、酵母膏5.0 g 、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 10.0 g、瓊脂20.0 g、水1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min 。

(2) 剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基

KH2PO40.5 g 、(NH4)2SO42 g、 纖維素粉 1.88 g 、MgSO4·7H2O 0.25 g 、剛果紅 0.2 g 、瓊脂 18 g、水1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min 。

(3) 羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉10.0 g、蛋白胨 10.0 g 、酵母粉5.0 g 、KH2PO41.0 g 、MgSO4·7H2O 0.2 g 、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min[18]146。

(4) 蛋白胨液體培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL、pH值為7.2～7.4 ，121 ℃ 滅菌20 min 。

(5) 葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基

葡萄糖 5.0 g、蛋白胨5.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL、pH值為7.2 ～ 7.4，121 ℃ 滅菌20 min[19]151。

1.3.2 樣品預(yù)處理

去除植物殘體等雜物，準(zhǔn)確稱取10.0 g土樣，加入至裝有 90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，用玻璃棒攪拌均勻。放入30 ℃、200 r·min-1條件下的振蕩培養(yǎng)箱中40 min，靜置2 h，取上清液便得10-1稀釋菌液。取1 mL菌液，加入裝有9 mL無菌水的試管中，反復(fù)吹打5次使菌液混合均勻，便得10-2菌液。按照上述方法，得到濃度為10-1、10-2、10-3、10-4四個梯度的菌液。

1.3.3菌株的初篩、復(fù)篩及菌株的分離

取10-2、10-3、10-4的適量菌液涂布于羧甲基纖維素瓊脂分離培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔12 h觀察一次，培養(yǎng)36 h后取出對菌落進(jìn)行觀察，根據(jù)菌落形態(tài)挑選菌落。將挑選出來的菌落重復(fù)劃線接種于羧甲基纖維素鈉平板分離培養(yǎng)基，直至純化出形態(tài)穩(wěn)定的單個菌落，觀察并記錄其菌落形態(tài)指標(biāo)。

將挑選純化出的單個菌落接種于裝有15 mL羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基的25 mL的試管中，置入37 ℃、180 r·min-1條件下的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)的試管充分振蕩后用移液槍吸取菌液，點(diǎn)接法接種于剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中，每個平板中接一種菌株,且菌液對稱的接種4個位置。將平板放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察一次，48 h后觀察透明圈，并記錄菌落的直徑(d)、透明圈的直徑(D)，計算D/d值。

1.3.4 菌株的鑒定

根據(jù)菌落的形態(tài)學(xué)特征初步鑒定菌株的種屬，對復(fù)篩出 D/d 值排名前三的菌株參考《微生物實(shí)驗(yàn)教程》[20]351做生理生化實(shí)驗(yàn)，包括甲基紅試驗(yàn)(MR試驗(yàn))、吲哚試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(vp試驗(yàn))、溴甲酚紫試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 纖維素粗酶活性測定

將復(fù)篩得到降解纖維素能力強(qiáng)的3 種菌株接種于裝有15 mL液體培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃、180 r·min-1條件下的振蕩培養(yǎng)5 d。在4 ℃ 、4 000 r·min-1，離心20 min；用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，在4 ℃、4 000 r·min-1，離心10 min ；使用超聲波處理20 min，在4 ℃、5 000 r·min-1，離心20 min，取上清液即得粗酶液。將粗酶液用乙酸-乙酸鈉緩沖液，稀釋10倍。

(1) DNS法測定最適波長的確定。 關(guān)于使用DNS法測定還原糖所用波長，在400～550 nm 都有報道[21]197,[22]535。取2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 mL 蒸餾水置于試管中，再各加2 mL DNS試劑，沸水浴10 min，流水冷卻，定容至15 mL，在400～740 nm 比色。

(2) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。如表1所示配制溶液，測定吸光值，應(yīng)用SPSS作回歸分析。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光值測定

(3) 纖維素酶活性測定。 吸取粗酶液0.2 mL 加入試管，加1%羧甲基纖維素緩沖液 1.8 mL混勻；在 40 ℃ 保溫 30 min 后，加入DNS試劑 2 mL，混勻后置于沸水浴中加熱10 min；流水冷卻，在選定最適波長下比色，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。定義酶活性單位( U) ：在40 ℃、pH6.8的條件下，每分鐘內(nèi)生成 1 μg·mL-1葡萄糖所需要的酶量(U·mL-1)[23]151,[24]3,[25]58。使用酶活性公式

計算酶的活性含量，其中：U為所測酶的活性，單位為U·mL-1；x為樣品OD值的平均值；a、b由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程確定；n為粗酶稀釋倍數(shù)；T為酶促反應(yīng)時間；0.2為所加酶液的體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩

將 10-1、10-2、10-3、10-4稀釋菌液分別涂布于羧甲基纖維素鈉瓊脂培養(yǎng)基在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，36 h 后根據(jù)其菌落形態(tài)挑取單個菌落，使用平板劃線法純化于羧甲基纖維素鈉瓊脂培養(yǎng)基，共篩選、純化出12株具有降解羧甲基纖維素鈉能力的菌株。

2.2 菌株的復(fù)篩

經(jīng)觀察并統(tǒng)計，對透明圈直徑及菌落直徑記錄，發(fā)現(xiàn)6株菌株可以產(chǎn)生透明圈，結(jié)果見表2。

表2 菌株的篩選

通過上述實(shí)驗(yàn)，共篩選出12株菌株具有羧甲基纖維素鈉降解能力，在進(jìn)行復(fù)篩時卻發(fā)現(xiàn)，只有6株菌株能夠產(chǎn)生透明圈。這說明SW-1、SW-4、SW-5、SW-9、SW-10、SW-11 菌株能夠利用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，但不能利用纖維素；或者說它們不適合在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3 菌株的鑒定

12株菌株通過連續(xù)5次的平板劃線接種，各菌株出現(xiàn)穩(wěn)定形態(tài)的菌落，菌落描述見下表3。

表3 12種菌株的形態(tài)學(xué)描述

可以看出，這些菌株之間的形態(tài)差異較大。在顏色上，有亮黃色、也有乳白色；菌落大小上，最小的菌落SW-9僅0.8 mm，最大的菌落SW-6約5.6 mm；形狀有突起也有扁平，產(chǎn)長菌絲也有短菌絲。

將D/d值排名前三的菌株SW-2、SW-3、SW-8進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表4。

表4 菌株SW-3、SW-8、SW-2生理生化測定

根據(jù)表3 、表4 結(jié)果，結(jié)合《伯杰細(xì)菌手冊》[26]3，初步鑒定SW-3 菌株為枯草芽孢桿菌，SW-8 菌株疑似芽孢桿菌屬一種。

2.4 纖維素酶活性的測定結(jié)果

2.4.1最適波長的確定

DNS法測還原糖含量的條件各異，對還原糖的測定也產(chǎn)生一定的影響[27]95,[28]84?？紤]到各種因素對實(shí)驗(yàn)的干擾，結(jié)合文獻(xiàn)報道，在 400～740 nm測定結(jié)果見圖1。

圖1 用DNS測定還原糖含量在不同波長下的吸光值

從圖1中可以看出，DNS試劑與葡萄糖反應(yīng)后的生成物在400～720 nm 范圍內(nèi)都有吸收值，在480～600 nm 范圍內(nèi)有明顯的吸收值。而DNS試劑在400～540 nm范圍內(nèi)具有吸光值，540 nm處基本不存在吸光值。為了避免DNS 試劑吸光值對生成物吸光值造成影響，所以要根據(jù)“吸收最大，干擾最小”的原則，選定的最適波長應(yīng)該在生成物具有較顯著的吸光值，而且DNS試劑的吸光值處于低水平。540 nm 處生成物具有較顯著的吸光值，而且DNS試劑的吸光值處于低水平，所以選擇540 nm 進(jìn)行還原糖測定，以提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確度[29]156。

2.4.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)表2配制的溶液，測得對應(yīng)的吸光值(A)，繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.874 3x-0.022 4，線性回歸系數(shù)R2=0.996 5，可用于酶活性測定。

2.4.3纖維素酶活性測定結(jié)果

將復(fù)篩得出的SW-3 、SW-8 、SW-2分別加入羧甲基纖維素液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min條件下的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d。經(jīng)離心、破碎和稀釋，制取 10-1粗酶液，使用DNS 法測定的纖維素粗酶活性見表5。

表5 三個菌株纖維素粗酶活性

由表5可以看出，SW-3菌株的酶活性最高，為849.805 U·mL-1，是SW-8酶活性的1.29倍，是SW-2菌株的1.75倍，而SW-8菌株酶活性是SW-2菌株的1.36倍。

3 討論

紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是熱帶、亞熱帶海岸帶海陸交錯區(qū)重要的、特殊的生態(tài)系統(tǒng)，具有維持生物多樣性、防風(fēng)消浪的作用，對重金屬、石油和生活污水等有較強(qiáng)的納污能力，對污染物有較強(qiáng)的凈化功能，而微生物在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[30]449。

本研究檢測到的12株菌株對羧甲基纖維素鈉具有降解能力，細(xì)菌最多；其中有6株菌株能夠降解纖維素，占總量的50%。對降解能力較高的3株菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定，得出降解能力最強(qiáng)的菌株SW-3為枯草芽孢桿菌，其粗酶活性為849 U·mL-1。篩選菌株的多與少，與取樣地點(diǎn)、季節(jié)、使用的培養(yǎng)基、樣品菌液的制備以及研究者對不同菌落的辨別能力都有關(guān)系，這還有待進(jìn)一步比較和研究。

如何在剛果紅瓊脂培養(yǎng)中接種是一個值得研究的問題。研究中采用了菌落點(diǎn)接法和打孔菌液接種法。其中菌落點(diǎn)接法接種試驗(yàn)中，培養(yǎng)3 d后未出現(xiàn)透明圈；打孔菌液接種法是在菌落上打孔，在孔中注入菌液培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)張潔娜等[19]151所述菌落生長，只見透明圈出現(xiàn)，不具評判菌種降解能力的意義。鑒于接種方法對透明圈的產(chǎn)生具有一定的影響，所以應(yīng)該對接種方法進(jìn)行比較研究，選擇對透明圈產(chǎn)生影響最少的方法進(jìn)行接種。同時還要考慮到菌種的接種量對透明圈產(chǎn)生的影響。

在酶活性測定方面，戴旭青等[24]113研究表明，篩選出的78株降羧甲基解纖維素鈉的菌株大部分是真菌，放線菌次之，細(xì)菌最少，酶活性最大值為1 074 U·mL-1。本研究中共篩選出 12 株菌，細(xì)菌最多，真菌次之，放線菌最少；40 ℃、pH 6.8條件下酶活性為849 U·mL-1，與上述研究有一定差異性。出現(xiàn)這種原因可能是從土樣中篩選出的菌株較少，對統(tǒng)計影響較大。馬軍等[16]977篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的枯草芽孢桿菌，在55 ℃、pH 6.8 條件下酶的活性為(1 253.2±16.629) U·mL-1。本研究中粗酶的活性低于其所測值，原因可能在于試驗(yàn)所用粗酶液未進(jìn)行提純且未進(jìn)行最適溫度、pH值測試。梁倩等[31]122篩選出3種菌，其所產(chǎn)纖維素酶學(xué)活性分別為977．92、1 089．79和 1 538．44 U·mL-1。從文獻(xiàn)中來看，真菌的纖維素酶活性低于芽孢桿菌。

DNS 法在測定還原糖含量的眾多方法中憑著其簡便、快速的特點(diǎn)被廣泛使用，但其中存在各種因素的干擾，確定測定的波長是DNS 法測定的重中之重。在本研究中，將各因素(葡萄糖、顯色液、水)在400～740 nm 波長下進(jìn)行測定，本著“吸收最大，干擾最小”的原則，選定了540 nm 的波長。王俊麗等[32]157研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)回歸系數(shù)和比耳定律，在葡萄糖含量為0～40 mg·L-1，520 nm為最適測定波長。本研究中采用的是1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)所用濃度，所以最適波長有所差別。劉最等[33]48、程鵬等[23]3、高建民[34]6等采用的也都是540 nm 的波長。

在今后的研究中，需要對菌株SW-3進(jìn)行細(xì)化的研究，包括應(yīng)用16sRNA、ITS 序列測定[35] 64,[36]42，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；對其生長曲線進(jìn)行測算，探索最佳繁殖條件。對其所產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行純化及性質(zhì)分析，對酶的最適溫度、最適pH值以及金屬離子對酶活性的影響進(jìn)行研究，以及對菌株的生長曲線和酶活性變化對應(yīng)關(guān)系和酶的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為制備降解纖維素菌劑提供依據(jù)。

4 結(jié)論

研究共篩選出12株具有降解羧甲基纖維素鈉能力的菌株，其中細(xì)菌最多，真菌次之，放線菌最少。對12株菌種進(jìn)行復(fù)篩，得到6株菌株具備降解纖維素能力，其中菌株SW-3的降解能力最強(qiáng)，鑒定其為枯草芽孢桿菌，其粗酶活性為849 U·mL-1。