王平安,楊 錚,劉利敏,楊 陽,岳 波,韓 巖,楊麥貴△,劉家云,胡恩亮

1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，陜西西安 710100；2.解放軍總醫(yī)院整形修復(fù)科，北京100853；3.陸軍第82集團(tuán)軍252醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北保定 071000；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，陜西西安 710032；5.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 710032

在臨床檢驗(yàn)工作中，筆者經(jīng)常發(fā)現(xiàn)XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)致白細(xì)胞形態(tài)變異，尤其是淋巴細(xì)胞項(xiàng)目報(bào)警，提示反應(yīng)性淋巴細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞增多，中性粒細(xì)胞不呈圓形或由橢圓形變?yōu)槎嘟切蔚炔灰?guī)則形態(tài)，可能是自動(dòng)推片系統(tǒng)致白細(xì)胞形態(tài)改變所致。淋巴細(xì)胞形態(tài)異常與臨床疾病的診斷密切相關(guān)，在實(shí)際工作中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞失去其正常、特有形態(tài)，似(看上去像)Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多，但這些改變與臨床疾病不相符，嚴(yán)重影響疾病的診斷。反應(yīng)性淋巴細(xì)胞主要由病毒、原蟲感染，藥物反應(yīng)，結(jié)締組織病，應(yīng)激狀態(tài)或過敏反應(yīng)等因素刺激而產(chǎn)生[1-3]，準(zhǔn)確的檢測結(jié)果對(duì)臨床疾病的診斷和治療都非常重要，為此，本研究主要探討了XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)對(duì)白細(xì)胞形態(tài)的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2019年4月于空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院和西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院進(jìn)行血細(xì)胞分析的受檢者238例，其中健康兒童(0～12歲)80例，健康成人(18～65歲)100例(健康兒童和健康成人納入健康對(duì)照組)，臨床及骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)確診的淋巴細(xì)胞性白血病26例(淋巴細(xì)胞性白血病組)，粒細(xì)胞性白血病17例(粒細(xì)胞性白血病組)，單核細(xì)胞性白血病15例(單核細(xì)胞性白血病組)。

1.2儀器與試劑 Sysmex XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)有TS-10前處理1臺(tái)(日本產(chǎn))，XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀7臺(tái)(日本產(chǎn))，SP-10全自動(dòng)血細(xì)胞推片儀2臺(tái)(日本產(chǎn))，DI-60全自動(dòng)閱片機(jī)2臺(tái)(日本產(chǎn))，OLYMPUS-BX51顯微鏡影像系統(tǒng)(日本產(chǎn))。其他儀器及試劑包括乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2，2.0 mg/mL)專用負(fù)壓管(廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司；批號(hào)：161205)，瑞姬染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：411071)，Sysmex Micro slide MS-101載玻片(日本產(chǎn))。

1.3方法 采用EDTA-K2專用負(fù)壓管采集所有受試者肘靜脈血，置于XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)進(jìn)行血細(xì)胞分析。分別用SP-10全自動(dòng)血細(xì)胞推片儀(儀器推片)和手工推制(手工推片)血膜片各2張，室溫干燥，再分別采用儀器瑞姬染色(儀器染色)和手工瑞姬染色(手工染色)。以上血涂片分別采用DI-60全自動(dòng)閱片機(jī)和人工閱片。人工閱片：由兩位技術(shù)熟練的主管技師根據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]，先用低倍鏡觀察，再用油鏡進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，分類計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞，特別注意淋巴細(xì)胞形態(tài)的變化。將分類計(jì)數(shù)的反應(yīng)性淋巴細(xì)胞結(jié)果取均值。反應(yīng)性淋巴細(xì)胞分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

2 結(jié) 果

2.1不同推片及染色方法的反應(yīng)性淋巴細(xì)胞分類比較 238例受試者EDTA-K2抗凝血手工推片儀器染色、手工推片手工染色與儀器推片手工染色、儀器推片儀器染色的Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。儀器推片后分別進(jìn)行儀器染色和手工染色，可見反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多，細(xì)胞體積大，外形不規(guī)則，著色不均，邊緣藍(lán)色較深，細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)細(xì)致，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫紅色，經(jīng)仔細(xì)辨別，似Ⅱ型(不規(guī)則型/單核細(xì)胞型)反應(yīng)性淋巴細(xì)胞(圖1～2)。手工推片后分別進(jìn)行手工染色和儀器染色，可見淋巴細(xì)胞形態(tài)基本正常，兩種方式染色對(duì)細(xì)胞形態(tài)沒有影響，而儀器推片致細(xì)胞形態(tài)異常，似Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。

表1 238例受試者EDTA-K2抗凝血不同推片、染色方法下的反應(yīng)性淋巴細(xì)胞分類比較

圖1 儀器推片手工染色鏡下表現(xiàn)(似Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞)

圖2 儀器推片儀器染色鏡下表現(xiàn)(似Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞)

2.2各組儀器推片與手工推片Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞結(jié)果比較 淋巴細(xì)胞性白血病組患者儀器推片的Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞為(85.2±5.6)%，明顯高于健康對(duì)照組、粒細(xì)胞性白血病組和單核細(xì)胞性白血病組儀器推片結(jié)果及各組的手工推片結(jié)果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組手工推片結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。淋巴細(xì)胞性白血病患者EDTA-K2抗凝血經(jīng)儀器推片后，細(xì)胞形態(tài)有明顯改變，似Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。見圖3。

表2 各組儀器推片與手工推片Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞結(jié)果比較

圖3 淋巴細(xì)胞性白血病患者淋巴細(xì)胞似Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞(儀器推片)

2.3各組儀器推片與手工推片形態(tài)不規(guī)則白細(xì)胞結(jié)果比較 除健康對(duì)照組，各組患者儀器推片分類的形態(tài)不規(guī)則白細(xì)胞數(shù)明顯多于手工推片結(jié)果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，健康對(duì)照組儀器推片結(jié)果與各組手工推片結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組儀器推片與手工推片形態(tài)不規(guī)則白細(xì)胞結(jié)果比較

3 討 論

粒細(xì)胞形態(tài)的變異對(duì)臨床疾病的診斷影響不大，因?yàn)樗鼘儆谌梭w血液細(xì)胞，基本結(jié)構(gòu)改變不大，而淋巴細(xì)胞屬于變形細(xì)胞，形態(tài)的變異對(duì)臨床疾病的診斷非常重要，因此本文主要探討淋巴細(xì)胞形態(tài)的變異。健康人群外周血中偶見反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，其值>5%有臨床意義，>10%時(shí)有診斷意義。反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多主要見于傳染性單核細(xì)胞增多癥、流行性出血熱、病毒性肝炎等病毒感染性疾病，弓形蟲病，自身免疫性疾病和過敏性疾病等。EB病毒、巨細(xì)胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒、梅毒螺旋體等感染也可引起反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多[1，5-6]。

以往白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)都采用末梢血人工直接推片、染色、分類，不需要抗凝。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，血細(xì)胞分析常使用XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)，需要使用EDTA-K2抗凝血，全自動(dòng)推片機(jī)模擬手工推片方式，利用楔形專用推玻片(Wedge Type)對(duì)已加載到載玻片上的血液標(biāo)本進(jìn)行推片。筆者在工作中發(fā)現(xiàn)，有的患者血細(xì)胞分析儀器自動(dòng)推片的白細(xì)胞形態(tài)變異，細(xì)胞體積變大，外形不規(guī)則，著色不均，邊緣藍(lán)色較深，細(xì)胞核不規(guī)則，呈淡紫紅色，似反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多，主要是Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞失去圓形或橢圓形態(tài)。引起細(xì)胞形態(tài)改變的可能機(jī)制:乙二胺四乙酸鉀鹽為高滲、高離子、低pH值，使白細(xì)胞膜鉀離子通道活化。鉀離子通道在白細(xì)胞活化過程中發(fā)揮著重要的作用。淋巴細(xì)胞膜上存在兩種類型的鉀離子通道：(1)電壓門控式鉀離子通道(Kv，分n、n′、I 3型)；(2)鈣激活的鉀離子通道(KCa)。鉀離子通道控制著細(xì)胞膜電位，細(xì)胞靜息膜電位主要是鉀離子經(jīng)Kv順濃度梯度流向細(xì)胞外形成的。淋巴細(xì)胞的膜電位與淋巴細(xì)胞的功能密切相關(guān)?？鼓獫{中鉀離子水平升高，阻滯膜內(nèi)鉀離子外流，使膜內(nèi)電位升高，產(chǎn)生去極化，去極化激活Kv，Kv可以上調(diào)淋巴細(xì)胞的活化過程。靜息的正常淋巴細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞表達(dá)10個(gè)左右的n型Kv，而激活的淋巴細(xì)胞可表達(dá)上百個(gè)n型Kv，使已激活的淋巴細(xì)胞在高鉀環(huán)境中更易活化，所以因高鉀活化的淋巴細(xì)胞易被自動(dòng)推片儀推成形態(tài)不規(guī)則的“假性Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞”[7-8]。本研究結(jié)果也證明EDTA-K2抗凝血儀器推片與手工推片Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞結(jié)果比較(表1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淋巴細(xì)胞性白血病組患者儀器推片的反應(yīng)性淋巴細(xì)胞結(jié)果明顯高于其他各組(P<0.05)；各組患者儀器推片分類的形態(tài)不規(guī)則白細(xì)胞數(shù)明顯高于手工推片結(jié)果(P<0.05)。這說明白細(xì)胞形態(tài)變異與各種方式染色無關(guān)，與推片方式有關(guān)，儀器推片可使白細(xì)胞變異為Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)對(duì)EDTA-K2抗凝白血病患者血液中活化、膨脹的白細(xì)胞無法調(diào)節(jié)推片力度，加之白血病患者的血細(xì)胞密度高阻力大，使自動(dòng)推片儀將活化膨脹的白細(xì)胞推制成Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞和不規(guī)則的白細(xì)胞，而手工推片可根據(jù)血細(xì)胞活化膨脹情況及細(xì)胞密度隨意調(diào)節(jié)角度、速度及力度，所以細(xì)胞形態(tài)不易改變，確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。李艷等[9]指出，EDTA-K2抗凝血反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多的可能原因：血液與玻璃試管接觸活化；抗凝劑刺激淋巴細(xì)胞活化；血液標(biāo)本放置時(shí)間過長，淋巴細(xì)胞退變、活化；體內(nèi)外溫差等細(xì)胞活化因素使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。

綜上所述，XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞檢測流水線系統(tǒng)雖然簡便快速，但不能直接提供血細(xì)胞形態(tài)變化的確切信息，不具備檢測血細(xì)胞形態(tài)的功能。EDTA-K2抗凝血采用該系統(tǒng)自動(dòng)推片會(huì)致患者白細(xì)胞形態(tài)變異，尤其是淋巴細(xì)胞性白血病患者，Ⅱ型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞(假性)增多，給臨床診斷治療帶來影響。在全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀報(bào)警或DI-60全自動(dòng)閱片機(jī)出現(xiàn)較多反應(yīng)性淋巴細(xì)胞時(shí)，必須采用手工推片手工染色，光學(xué)顯微鏡復(fù)檢確證后方可報(bào)告，確保為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。