王娟

(豪沃生物科技(上海)有限公司,上海200050)

1 項目概況

小動物腦電肌電記錄系統(tǒng)主要是用于進行大鼠或小鼠腦電肌電記錄、睡眠評價、睡眠剝奪、同步視頻采集等試驗的儀器設(shè)備及軟件。該項目包含以上所有設(shè)備的安裝與信號調(diào)試,動物手術(shù)實驗操作、信號采集、腦電睡眠評分分析的培訓(xùn)等內(nèi)容。

該項目的重點和難點集中在動物的電肌電采集設(shè)備的安裝與調(diào)試、腦電和肌電電極安裝的手術(shù)操作、如何通過腦電與肌電對自由活動動物的清醒、快速眼動睡眠和非快速眼動睡眠狀態(tài)進行準(zhǔn)確客觀的區(qū)分,并進行時長和睡眠- 覺醒次數(shù)的統(tǒng)計,以用于后續(xù)藥物干預(yù)實驗的藥效評價。

2 整體結(jié)構(gòu)及工作原理

2.1 整體結(jié)構(gòu)

該小動物腦電肌電記錄系統(tǒng)的硬件部分包含數(shù)據(jù)采集和調(diào)理器、萬向轉(zhuǎn)向器、前置放大器、動物腦電肌電電極及配件、頭帽、視頻采集系統(tǒng)等；軟件部分包含數(shù)據(jù)采集和睡眠專業(yè)分析軟件。該套系統(tǒng)的整體架構(gòu)為將已放置好電極的動物放置于清醒活動籠中,使其自由活動、飲水和取食,同時平板支架上的攝像頭對其活動進行不間斷拍攝,重量極輕的前置放大器插入連接適配器(頭帽)中,并連接轉(zhuǎn)向器和數(shù)據(jù)采集器,信號數(shù)據(jù)通過USB 連接線接入電腦軟件中。(圖1)

2.2 工作原理

該系統(tǒng)使用植入動物腦皮層的特質(zhì)螺釘電極引入腦電、以鉑絲植入動物頸部肌肉引入活動肌電,電信號經(jīng)過前置放大器經(jīng)過初步的放大和過濾,經(jīng)過數(shù)據(jù)采集和調(diào)理器進行二次放大和過濾,待植入電極的動物恢復(fù)5-7 天后,通過數(shù)據(jù)采集軟件記錄其動物皮層腦電(2 通道信號)和頸部肌電(1 通道信號),記錄過程中動物為清醒自由活動的狀態(tài),可通過長時間的記錄來研究動物生理或疾病狀態(tài)下清醒和睡眠狀態(tài)。萬向轉(zhuǎn)向器可防止動物在自由活動中信號線的打結(jié)與纏繞,保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確傳輸至采集軟件中。清醒活動籠籠壁有專門的開孔,用于放置水瓶和垂直不銹鋼食槽,以維持動物正常的飼養(yǎng)環(huán)境,保證實驗準(zhǔn)確有效的進行。睡眠專業(yè)分析軟件通過對采集的腦電和肌電信號進行再次分析,如進行濾波、傅里葉變換等處理,得到頻譜圖、熱圖等,以此作為清醒、非快速眼動和快速眼動的評分基礎(chǔ),通過時段區(qū)分得到動物的平均睡眠和清醒時長、時相轉(zhuǎn)化次數(shù)、睡眠時相序列圖、不同評分人員數(shù)據(jù)對比等統(tǒng)計數(shù)據(jù),最后用于睡眠模型、新藥研發(fā)、上市藥物評估等不同的課題或研究方向。

圖1 小動物腦電肌電系統(tǒng)整體演示圖

3 儀器安裝

3.1 儀器元部件安裝

數(shù)據(jù)采集器和前置放大器需要按照正確的方向和連接才能獲得穩(wěn)定精確的信號：前置放大器的6 個引腳分別為接地電極、參考電極、腦電1、腦電2、肌電左、肌電右的信號,使采集器可最終采集到2 通道腦電和1 通道肌電的信號。

同步視頻采集系統(tǒng)的視頻采集卡為PCI 接口,不同于市面上通用的USB 接口,要求安裝的電腦必須具備空閑的、且散熱風(fēng)扇不能阻擋視頻采集卡安裝方向的PCI 接口,安裝前要打開電腦主機確認主板內(nèi)的PCI 接口位置,據(jù)此判斷電腦是否適合安裝,或者是否需要額外適配專用的連接線。該系統(tǒng)最多可同時連接8 個攝像機同時工作,每個攝像機接口具有對應(yīng)的顏色作為標(biāo)識。其它顏色對應(yīng)的通道序號如圖2 所示。

圖2 相機序號與對應(yīng)的顏色標(biāo)識對照表

單通道默認連接紅色端口,相機通道1。攝像機可通過螺母安裝到不銹鋼平板上,使其可完全覆蓋動物的活動范圍。

3.2 軟件、硬件驅(qū)動安裝和設(shè)置

在硬件驅(qū)動和軟件安裝的過程中,部分電腦可能會缺少配置文件而造成安裝失敗。軟件會經(jīng)常出現(xiàn)缺少特定的dll 配置文件的錯誤提示,將該文件拷貝至電腦系統(tǒng)盤中,緊接著還會跳轉(zhuǎn)到缺少另一個dll 配置文件的錯誤提示中,此時應(yīng)將軟件所需要的所有dll 配置文件拷貝至C 盤指定路徑中可解決安裝錯誤問題。軟件運行完成后,在電腦設(shè)備管理器的“通用總線控制器”中查找EEG/EMG 驅(qū)動,判斷其是否已經(jīng)成功安裝并識別,若驅(qū)動安裝失敗,需要根據(jù)電腦的系統(tǒng)參數(shù)查找指定的禁用驅(qū)動程序簽名的方法來修改驅(qū)動的數(shù)字簽名,最終硬件驅(qū)動程序才能正確安裝。

在數(shù)據(jù)采集記錄軟件中設(shè)置信號采樣率：400Hz；放大倍數(shù)：100。正式實驗前,需要使用數(shù)據(jù)信號源測試硬件是否能正常運行,觀察采集測試界面信號,腦電1,腦電2,肌電處應(yīng)出現(xiàn)±75uV的正弦信號,證明數(shù)據(jù)采集器和前置放大器可以正常運行。

在信號采集軟件中添加并設(shè)置攝像機參數(shù),選擇相機1(紅色標(biāo)識)代表的相機序列號,若誤選其它序號,將導(dǎo)致畫面無信號。攝像頭添加過程中易出現(xiàn)以下4 種問題：(1)無視頻信號：排除序號選錯的問題,無視頻信號標(biāo)識視頻軟件驅(qū)動沒有自動安裝成功,需要重新打開驅(qū)動安裝包進行手動安裝。(2)畫面黑屏：此時應(yīng)檢查電源線是否連接、相機開關(guān)是否正常、延長線是否有連接失誤等。(3)畫面質(zhì)量較差,出現(xiàn)雪花：此時應(yīng)檢查視頻信號線,即BNC 轉(zhuǎn)VGA連接線是否連接牢靠。(4)視頻畫面滾動,無法穩(wěn)定：需要在電腦regedit 界面中將視頻軟件的注冊序號更改為“1”,方可解決該問題。

成功記錄到腦電肌電最重要的是電極的準(zhǔn)確放置：將頭帽粘在顱骨前囟點前2-3mm 的位置,此位置能夠記錄到較為明顯的前額葉皮層的腦電信號。對小鼠顱骨進行鉆孔時應(yīng)注意力度的把握,緩慢旋轉(zhuǎn)針頭,既要保證鉆孔大小正好能夠使螺釘電極緊密的擰入小鼠顱骨,又要保證剛好穿透硬腦膜,且不會對腦組織產(chǎn)生損傷。操作時須采用顯微彎鑷固定住螺釘頭部,用力慢慢旋轉(zhuǎn)螺釘,該操作過程中應(yīng)感到越擰越緊,但要預(yù)留1mm 的位置,不要擰到最緊。按上述方法在動物頭部共打入4枚螺釘電極,使用電流表進行檢測,所有信號路徑為通路時,驗證電極安裝成功。為增強電極的導(dǎo)電性,應(yīng)在螺釘未擰緊處涂抹銀膠,該過程中要防止過多的銀膠使螺釘與螺釘之間短路。

4 信號調(diào)試與優(yōu)化

4.1 信號調(diào)試

小鼠恢復(fù)5-7 天后進行腦電和肌電電信號調(diào)試[2]。將前置放大器按指定方向插入頭帽裝置,打開軟件觀察腦電肌電信號形態(tài)。正常大小鼠皮層腦電主要呈現(xiàn)不規(guī)律的波形,頻率范圍0-30Hz,與人類腦電類似,在清醒時振幅一般在100uV 以下。而小鼠肌電信號隨著動物的活動狀態(tài)會出現(xiàn)顯著的改變,活動時,肌電信號頻率和振幅都明顯增加,安靜時,電信號頻率規(guī)則,振幅較小,能夠維持在10uV 左右。如圖3 所示。

在信號調(diào)試過程中,可能會遇到信號異常的情況,需要分析原因并進行調(diào)整,以獲得最正確的生理信號。

4.1.1 若腦電波形隨動物的活動出現(xiàn)大幅度的變化,振幅遠超過正常范圍,則需要重新調(diào)整電極的安裝,尤其注意螺釘在擰入顱骨時不能過松,否則即會出現(xiàn)腦電記錄基線不穩(wěn),甚至大幅度變化的情況(圖4),該過程中也不能造成過量的出血,凝固的血液會影響螺釘電極表面電阻,造成腦電信號失真甚至無信號的情況發(fā)生。

圖3 野生型小鼠正常的腦電肌電波形

圖4 野生型小鼠異常腦電與肌電波形

圖5 野生型小鼠睡眠分析例圖

4.1.2 若肌電信號的振幅不隨動物的活動而發(fā)生改變,且幅值接近0uV,說明肌電電極在動物頸部被折斷,需要下次在安裝肌電電極的步驟中保證肌電線不被過度彎折。

4.1.3 若在肌電信號中摻雜了大量心電信號,說明肌電電極放置在了小鼠的皮下而非肌肉內(nèi)部,需要重新安裝肌電電極(圖4)。

4.2 整體優(yōu)化與小鼠睡眠分析

4.2.1 記錄到的小鼠腦電可細分為α、β、θ、δ、γ 五種波形,在睡眠專業(yè)分析軟件中,首先使用功率分析定義小鼠α、β、θ、δ、γ 各自的頻率范圍(帶通濾波)。δ 波：0.5-4Hz; θ波：5.5-8.5Hz；α 波：8-13Hz；β 波：13-30Hz；γ 波：35-44Hz。設(shè)置陷波50Hz 以濾除外界環(huán)境噪音。

4.2.2 對小鼠進行半自動化睡眠評分,對于長時間的監(jiān)測數(shù)據(jù),首先常采用散點評分。動物的清醒狀態(tài)可由肌電振幅幅值大小直接判斷。非快速眼動狀態(tài)(Non-Rem)是清醒和深度睡眠的過渡階段,其具有相對突出的腦電信號特征,即在δ 波波段處信號功率明顯高于其它頻率波段,且肌電信號處于基線水平[3]；快速眼動睡眠(Rem)屬于深度睡眠,其腦電信號特征較為模糊,主要表現(xiàn)為δ 波與θ 波的混合波形[4],相對之下表現(xiàn)為δ波功率較低,且肌電信號處于基線水平。因此在散點評分中,Y軸選擇δ 波功率,X 軸選擇肌電功率,每個點表示每10s 的腦電或肌電信號,根據(jù)各個點的功率分布可將散點劃分為三個區(qū)域,可分別初步歸類為清醒,non-Rem,Rem 時段。

4.2.3 其次選擇頻譜分析,對初步分析未歸類的譜圖進行人工手動分析,頻譜圖是對每10s 的腦電肌電信號進行傅利葉變換得到的圖形,橫坐標(biāo)為頻率,縱坐標(biāo)為功率,可通過此頻譜圖進一步精確睡眠分析。經(jīng)過半自動和手動相結(jié)合的分析方法,最終對一段長時程的腦電肌電數(shù)據(jù)進行睡眠的評分和統(tǒng)計。如圖5 所示。

5 結(jié)論

小動物腦電肌電記錄和睡眠分析系統(tǒng)經(jīng)過硬件和軟件調(diào)試、電極安裝、信號濾波和頻譜分析,能夠高效、準(zhǔn)確的對小鼠的腦電肌電信號進行數(shù)據(jù)采集和睡眠時段分析,可獲得動物長時間,如1h 甚至幾天內(nèi)的活動視頻、腦電肌電生理信號波形及清醒和睡眠時間、次數(shù)等實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果,24h 的信號數(shù)據(jù)最快10分鐘即可分析完成。該系統(tǒng)提供成品化的信號電極與前置放大器,且能夠半自動化的獲取動物的睡眠相關(guān)的參數(shù)信息,改善了以往手動制作電極造成的信號不穩(wěn)定、手動分析信號緩慢易錯的缺陷,成為了睡眠研究必不可少的實驗工具和平臺,是現(xiàn)代基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)研究的有力工具。