張英楠，張桂山，徐 晶，楊樹寶,3,*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.長(zhǎng)春科技學(xué)院；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院)

目前，家禽的呼吸道疾病如禽流感和新城疫等給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失，而肺臟又是家禽許多病毒性和細(xì)菌性疾病的主要靶器官，病原體會(huì)通過(guò)肺呼吸系統(tǒng)黏膜表面進(jìn)入宿主，然后進(jìn)一步散布到其他器官中。因此，動(dòng)物的健康在很大程度上取決于是否能夠成功控制病原在肺臟組織尤其是肺臟支氣管黏膜表面的入侵和復(fù)制?？乖蔬f細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APC)是指能夠攝取、加工處理抗原，并將處理過(guò)的抗原呈遞給T、B淋巴細(xì)胞的一類免疫細(xì)胞。研究表明,肺臟中的APC在肺免疫性疾病,如哮喘、特發(fā)性纖維化及病毒感染等疾病中具有重要的免疫學(xué)意義。主要組織相容性復(fù)合體II類分子(major histocompatibility complex-II，MHC-II)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，負(fù)責(zé)抗原遞呈，在自我識(shí)別的機(jī)體系統(tǒng)中使特異性T淋巴細(xì)胞檢測(cè)到外來(lái)抗原。因此，MHC-II分子是抗原呈遞細(xì)胞膜表面的主要細(xì)胞識(shí)別標(biāo)志。

孵化期間由蛋殼氣孔過(guò)濾后的氣體是禽類的氧氣供應(yīng)源。出殼之后，雛禽開始接觸外界空氣，并逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，同時(shí)其呼吸道結(jié)構(gòu)和功能也得到發(fā)育和建立。出殼初期為了適應(yīng)外界環(huán)境，雞的肺臟也經(jīng)歷著相應(yīng)的快速變化。伴隨著肺臟結(jié)構(gòu)和功能的一系列轉(zhuǎn)變，肺臟的免疫功能也應(yīng)發(fā)生著相應(yīng)的變化，其中抗原呈遞細(xì)胞的發(fā)育及呈遞功能的發(fā)生至關(guān)重要，將決定是否能夠及時(shí)并有效的產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此本研究采用免疫組織化學(xué)方法研究從雞胚到出殼后的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，肺臟中MHC-II+細(xì)胞的發(fā)育情況以及定位分布變化，從而反映發(fā)育時(shí)期雞肺臟的免疫狀態(tài)變化，為進(jìn)一步研究家禽肺臟的免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

200個(gè)海蘭褐SPF種蛋，購(gòu)自吉林卓越生物科技有限公司。種蛋進(jìn)行常規(guī)孵化，雛雞進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及用具

冰凍切片用OCT組織包埋液購(gòu)自美國(guó)Sakura公司；小鼠抗雞MHC-II單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Southern Biotechnology公司；Ultra Sensitive SP超敏試劑盒kit 9901購(gòu)自福州邁新公司。

依愛EIF/C.DME3456 孵化機(jī)/出雛機(jī)(廣東依愛孵化機(jī)廠生產(chǎn))，Leica CM1850 冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司生產(chǎn))，Olympus CX41 顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))，Pixera pro150ES圖像采集器(美國(guó)Pixera公司生產(chǎn))。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

200個(gè)海蘭褐SPF種蛋進(jìn)行孵化，雞出殼后置于動(dòng)物室中常規(guī)飼養(yǎng)。分別選擇未經(jīng)過(guò)疫苗免疫的11、13、15、18、20日胚齡雞胚，1、4、7、14、21、35、56和90日齡的雛雞，每個(gè)時(shí)期取3只雞胚或雛雞的肺臟組織。將肺臟組織制成冰凍切片，片厚5 μm，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學(xué)染色程序

每張切片滴加30 ml/L過(guò)氧化氫，室溫下孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每張切片分別滴加小鼠抗雞MHC-II單克隆抗體工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每張切片滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每張切片加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；自來(lái)水沖洗返藍(lán)；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片；照相。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測(cè)定肺臟中單位視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞面積。每張切片測(cè)3個(gè)視野，取平均值。應(yīng)用SPSSl8.0軟件對(duì)不同日齡的同一陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 胚胎期肺臟中MHC-Ⅱ+細(xì)胞的分布規(guī)律

13日胚齡，MHC-Ⅱ+細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)在肺臟中，由于此時(shí)肺臟的組織結(jié)構(gòu)仍處于發(fā)育早期，很難辨別MHC-Ⅱ+細(xì)胞分布的準(zhǔn)確位置，似乎是出現(xiàn)在大的肺內(nèi)導(dǎo)管-初級(jí)支氣管或次級(jí)支氣管周圍(圖1A)。

15日胚齡，各種免疫細(xì)胞中也只有MHC-Ⅱ+細(xì)胞存在，而且數(shù)量明顯增多，而且分布范圍變廣，較多地分布于由三級(jí)支氣管管壁內(nèi)陷所剛剛形成的肺房的房間隔中(圖1B)。

18日胚齡與20日胚齡的發(fā)育狀況相近，分布在房間隔上的MHC-Ⅱ+細(xì)胞繼續(xù)增多(圖1C)。

2.2 出殼后初期肺臟中MHC-Ⅱ+細(xì)胞的分布規(guī)律

1日齡時(shí)，MHC-Ⅱ+細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增多，MHC-Ⅱ+細(xì)胞除分布在房間隔上外，還在小葉間結(jié)締組織中有分布(圖1D)。

4日齡時(shí)，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色可見，在初級(jí)支氣管與次級(jí)支氣管交匯處有淋巴細(xì)胞的聚集物，即形成了明顯的支氣管相關(guān)性淋巴組織(BALT)。從此時(shí)起，肺臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞就以兩種形式存在，一是集合性淋巴組織—BALT，另外就是散布在肺小葉中的彌散性淋巴組織。此時(shí)BALT中的大多數(shù)細(xì)胞都表達(dá)MHC-Ⅱ，成為主要的細(xì)胞群體(圖1E)。除了形成BALT外，肺臟肺小葉中的各種免疫細(xì)胞的數(shù)量也較之前日齡明顯增加，MHC-Ⅱ+細(xì)胞開始分布在三級(jí)支氣管氣道內(nèi)壁中(圖1F)。

7日齡時(shí)，BALT更為發(fā)達(dá)，MHC-Ⅱ+細(xì)胞在房間隔和小葉間結(jié)締組織中也有大量分布(圖1G)。

14日齡時(shí)，呼吸性毛細(xì)管管壁上的出現(xiàn)較多的MHC-Ⅱ+細(xì)胞(圖1H)。

2.3 21-90日齡肺臟中MHC-Ⅱ+細(xì)胞的分布規(guī)律

21日齡時(shí)，BALT特別發(fā)達(dá)，其中MHC-Ⅱ+細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖2)，而且除了BALT中之外，MHC-Ⅱ+細(xì)胞已遍布全肺(圖1I)。

35日齡時(shí)，無(wú)論是BALT中，還是肺小葉中MHC-Ⅱ+細(xì)胞的數(shù)量都持續(xù)增加(圖1J，圖2)。

56和90日齡時(shí)，MHC-Ⅱ+細(xì)胞的分布部位和數(shù)量與35日齡時(shí)基本一致，無(wú)明顯變化(圖1K，圖1L，圖2)。

圖1 胚胎期和出殼后各時(shí)期雞肺臟中MHC-Ⅱ+細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化

圖2 BALT中MHC-Ⅱ+ 細(xì)胞的數(shù)量變化

3 討論

在禽類養(yǎng)殖中，呼吸系統(tǒng)的疾病是影響?zhàn)B殖的疾病之一，給養(yǎng)殖業(yè)也帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)黏膜表面進(jìn)行疫苗接種是阻止致病菌的入侵機(jī)體的主要方法，如滴鼻點(diǎn)眼和噴霧等接種方法。為了研制適合雞使用且可以提供有效免疫保護(hù)的黏膜新型疫苗，就需要對(duì)雞肺臟相關(guān)免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的有綜合的了解。但目前還缺乏有關(guān)雞肺相關(guān)免疫系統(tǒng)的知識(shí)。

抗原呈遞細(xì)胞尤其是樹突狀細(xì)胞是肺臟免疫微環(huán)境的重要組成部分和免疫前哨細(xì)胞，它與其它免疫活性細(xì)胞共同構(gòu)成了肺臟的免疫屏障，具有免疫監(jiān)視及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用，同時(shí)也是特異性和非特異性免疫反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞。研究表明，大鼠肺臟樹突狀細(xì)胞在胚胎及出生時(shí)處于發(fā)育不完善狀態(tài)，包括數(shù)量偏少，MHC-II 分子表達(dá)過(guò)低，處理抗原提呈功能較弱等，與成年鼠的水平存在差距，這可能是幼鼠呼吸道抵抗力低下的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，13日胚齡時(shí)，MHC-Ⅱ+細(xì)胞已經(jīng)較早地出現(xiàn)在肺臟中，由于此時(shí)肺臟的組織結(jié)構(gòu)仍處于發(fā)育早期，很難辨別MHC-Ⅱ+細(xì)胞分布的準(zhǔn)確位置，似乎是出現(xiàn)在大的肺內(nèi)導(dǎo)管-初級(jí)支氣管或次級(jí)支氣管周圍。隨后胚胎期各日齡以及出殼后1日齡，MHC-Ⅱ+細(xì)胞數(shù)量隨有所增加，但并不顯著，這也在一定程度上證明雞在胚胎期以及剛出殼時(shí)由于缺少抗原呈遞細(xì)胞而導(dǎo)致呼吸道免疫力低下，容易受到病原菌的侵?jǐn)_。