外源8'-炔基脫落酸對高羊茅抗旱性的影響

龔定芳，孫 杰，趙萍萍，胡 憶

（中南民族大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北武漢 430074）

本文選用高羊茅為植物材料，通過PEG模擬干旱脅迫的方法：探究了葉面噴施8'-（C2H）ABA對25%PEG脅迫下高羊茅生長、相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、光合性能、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等的影響，初步探討了8'-（C2H）ABA作用于高羊茅耐干旱脅迫的效應(yīng)，對比分析了8'-（C2H）ABA 和ABA對高羊茅抗干旱能力的差異性，旨在為8'-（C2H）ABA在植物抗干旱上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用高羊茅為實驗對象，種植于實驗室溫室內(nèi)，備實驗用，溫室最高/最低溫度為24/20℃，光照時長為12 h/d。所施加的脫落酸（ABA，純度為95%）購于上海源葉生物科技有限公司、ABA類似物（8'-（C2H）ABA，純度為95%）購于武漢艾布斯生物科技有限公司，所用濃度皆為20 mg·L-1；施加方式皆為葉面噴灑，且在夜間進(jìn)行。

1.2 實驗設(shè)計

選用生長良好、長勢基本一致的40天齡高羊茅幼苗，移至含有1/2 Hoagland溶液的錐形瓶中，并將其置于溫室培養(yǎng)7天。待幼苗恢復(fù)正常生長，將幼苗移入250mL錐形瓶（10株/瓶）中，采用PEG6000模擬干旱脅迫，進(jìn)行試驗處理，即進(jìn)行以下4個實驗處理，具體如下：CK（1/2Hoagland營養(yǎng)液）、DS（25%PEG+1/2Hoagland營養(yǎng)液）、DS+ABA（20 mg/L ABA+25%PEG+1/2Hoagland營養(yǎng)液）、DS+8'-ABA（20 mg/L 8'-（C2H）ABA +25%PEG+1/2Hoagland營養(yǎng)液），每個處理 4個重復(fù)。ABA及其類似物8'-（C2H）ABA噴灑處理以葉片濕潤而不滴水為限，且在開始進(jìn)行干旱脅迫的當(dāng)晚進(jìn)行。處理7天后分別測定高羊茅葉片的葉綠素含量，相對含水率，相對電導(dǎo)率，丙二醛（MDA），超氧陰離子（O2—），可溶性蛋白質(zhì)，可溶性糖，主要抗氧化酶（SOD、POD、CAT）等相關(guān)指標(biāo)。

1.3 項目測定方法

高羊茅葉片中葉綠素含量采用手持式葉綠素?zé)晒鈨xSPAD-502進(jìn)行測定，相對電導(dǎo)率（REC）采用電導(dǎo)儀法測定，相對含水率（RWC）和超氧陰離子（O2—）的測定參照聶堅等方法進(jìn)行。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法（TBA）法測定，參照李合生等的方法進(jìn)行測定。

蛋白質(zhì)及其各抗氧化酶活性的前處理提取方法相同，方法過程：稱取0.2～0.3g新鮮植物葉片，加入3 ml預(yù)冷的50 mmol/L且含有1 mmol/L EDTA和2% PVP的磷酸緩沖液（pH 7.4），在冰浴條件下研磨至勻漿，轉(zhuǎn)至離心管中，再用2ml清洗研缽并倒入離心管中，在4℃條件下8 000 r/min離心10 min，取上清液用來測定蛋白質(zhì)含量、SOD、POD、CAT酶的活性。

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，參照李合生等的測定方法進(jìn)行。采用試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司）對樣品中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性進(jìn)行分析測定，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，SPSS20.0進(jìn)行誤差分析，利用Origin9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅生長狀況

高羊茅遭受干旱脅迫后展現(xiàn)出不同的生長狀況，未受干旱處理的高羊茅生長正常，當(dāng)遭受干旱脅迫后，生長受阻變慢，植株矮小且葉片隨著干旱程度的加深逐漸卷曲；而DS+8'-ABA和DS+ABA組的高羊茅草植株生長情況好于DS組。結(jié)果說明，8'-（C2H）ABA和ABA能夠一定程度地提高高羊茅的耐旱性。

圖1 四種處理對高羊茅葉片相對含水量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

由圖1可知，干旱脅迫7天后，高羊茅葉片的相對含水量均有下降的趨勢。與對照組（CK）相比，干旱處理（DS）明顯降低了高羊茅相對含水量，而DS+8'-ABA和DS+ABA處理使高羊茅的相對含水量高于DS組，分別較DS處理提高了6.1%、7.4%（P＜0.05）。此結(jié)果說明，高羊茅遭受干旱脅迫后相對含水量有所下降，而8'-（C2H）ABA和ABA則降低了下降速度，使高羊茅的相對含水量高于干旱組。說明在干旱條件下，8'-（C2H）ABA和ABA均能降低高羊茅葉片水分的散失，保持葉片較高的相對含水量，維持其生理生化的正常運轉(zhuǎn)，從而增強其抗旱能力。

2.2 高羊茅葉綠素含量的變化

8'-（C2H）ABA和ABA處理對干旱脅迫下高羊茅葉綠素含量的影響如圖2所示。干旱處理7天后，高羊茅葉綠素含量明顯下降，而DS+8'-ABA和DS+ABA處理與DS均提高了葉綠素含量，使葉綠素含量較DS分別增加了9.0%、8.1%。結(jié)果說明，干旱脅迫使葉綠素含量降低，而8'-（C2H）ABA和ABA處理提高了干旱條件下葉綠素含量，從而促進(jìn)高羊茅生長，降低了干旱對高羊茅的損害，說明適量的8'-（C2H）ABA和ABA能一定程度地提高高羊茅的抗旱能力。

圖2 四種處理對高羊茅葉綠素含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

圖3 四種處理對高羊茅葉片中MDA含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

2.3 高羊茅葉片中丙二醛含量的變化

由圖3可知，干旱脅迫下，高羊茅葉片中丙二醛（MDA）的含量明顯增加，DS較CK增加了2.2倍，而DS+8'-ABA和DS+ABA處理則明顯降低了高羊茅葉片中MDA的含量，且較DS分別降低了40.6%、53.1%（P＜0.05）。以上結(jié)果表明干旱處理使高羊茅發(fā)生氧化脅迫，造成氧化損傷，導(dǎo)致MDA含量增加，但8'-（C2H）ABA和ABA處理可以降低氧化損傷的程度使MDA含量降低，從而使高羊茅抗干旱能力增強。

在干旱脅迫的環(huán)境中，植物細(xì)胞會積累大量的活性氧，導(dǎo)致植物細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量的多少可以反映植物遭受傷害的程度。在本實驗中，高羊茅在干旱脅迫的作用下，其體內(nèi)MDA水平呈上升的趨勢，這說明了干旱脅迫對高羊茅的細(xì)胞膜造成了一定的傷害；但經(jīng)8'-（C2H）ABA和ABA處理后，MDA水平整體上升的趨勢降低，說明了8'-（C2H）ABA和ABA能夠緩解干旱對高羊茅的傷害程度，使其抗旱能力增強。

2.4 高羊茅葉片中超氧陰離子含量的變化

植物正常生理代謝過程中會產(chǎn)生自由基，而植物本身的抗氧化系統(tǒng)能及時地清除自由基以保持其在體內(nèi)的相對穩(wěn)定，高羊茅葉片中超氧陰離子（O2—）含量的變化如圖4所示。正常生長條件下，高羊茅體內(nèi)存在一定含量的O2—；當(dāng)干旱處理7天后，高羊茅體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)無法清除掉過量積累的O2—，DS處理使其增加了43.5%（P＜0.05）；DS+8'-ABA和DS+ABA處理使高羊茅體內(nèi)的O2—含量明顯降低，較DS分別降低了14.7%、19.8%（P＜0.05）。結(jié)果說明，ABA 和8'-（C2H）ABA處理降低了干旱條件下高羊茅體內(nèi)過量積累的O2—，緩解了干旱對高羊茅帶來的氧化損傷，從而進(jìn)一步說明ABA 和8'-（C2H）ABA能夠提高高羊茅的抗旱能力。

圖4 四種處理對高羊茅葉片中超氧陰離子含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

2.5 高羊茅葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)重要的三種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物響應(yīng)干旱脅迫最常見的反應(yīng)之一，植物對干旱的重要生理適應(yīng)方式就是滲透調(diào)節(jié)。干旱處理和8'-（C2H）ABA處理對高羊茅葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的影響如圖5、6所示。

圖5 四種處理對高羊茅葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

由圖5可知，處理7天后，DS處理降低了高羊茅葉片中蛋白質(zhì)含量，而DS+8'-ABA和DS+ABA處理均能提高蛋白質(zhì)的含量以響應(yīng)干旱脅迫，一定程度提高其抗旱能力。這說明一定濃度的外源ABA 和8'-（C2H）ABA均能提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)蛋白質(zhì)的含量，維持體內(nèi)滲透壓，有助于細(xì)胞或組織吸水，從而進(jìn)一步提高其抗旱能力。

由圖6可知，DS處理的高羊茅葉片中可溶性糖的含量增加，較CK增加了36.1%（P＜0.05）。DS+8'-ABA和DS+ABA處理使干旱條件下高羊茅葉片中可溶性糖的含量均降低，較DS分別降低了21.2%、45.4%（P＜0.05），且DS+8'-ABA處理低于CK。實驗結(jié)果表明，雖然8'-（C2H）ABA和ABA處理均降低了干旱條件下可溶性糖的含量，但DS+8'-ABA和DS+ABA處理之間存在明顯差異，還需進(jìn)一步研究。

圖6 四種處理對高羊茅葉片中可溶性糖含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）

3 討論

干旱脅迫作為一種非生物脅迫，影響著植物生理代謝的各個方面。干旱其誘導(dǎo)的化學(xué)信號中，ABA是主要的化學(xué)信號，通常在植物根部合成，并運輸?shù)饺~片中調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，或在葉片中快速生物合成并對氣孔關(guān)閉做出反應(yīng)。ABA介導(dǎo)氣孔關(guān)閉并消除脅迫條件的限制，以調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育。ABA能通過多種途徑來完成對植物抗逆性的調(diào)節(jié)作用，如提高植物體內(nèi)滲透物質(zhì)的含量和酶活性，或者直接調(diào)節(jié)相關(guān)抗旱基因表達(dá)等，但無論是哪種途徑都表明ABA可以作為一種防御信號提高植物的抗逆性。ABA在植物應(yīng)對干旱、寒害、鹽害等脅迫環(huán)境時起著重要的作用。大量研究表明，施加一定的外源物質(zhì)（如脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯等）可增強植物對氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素的吸收，以促進(jìn)植物正常生長發(fā)育，緩解干旱對植物造成的傷害。

相對電導(dǎo)率是反映植物抗逆能力的一個重要生理指標(biāo)，當(dāng)處于干旱等逆境環(huán)境時，植物細(xì)胞膜會受到一定程度的損害，使植物體內(nèi)的細(xì)胞膜透性發(fā)生變化，細(xì)胞質(zhì)外滲，從而使電解質(zhì)的濃度也不斷增加，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率呈向上的趨勢。目前，研究植物的抗逆能力比較常用的一種生理指標(biāo)就是相對電導(dǎo)率，其高低在一定程度上反映了植物抵御干旱脅迫的能力。本試驗中，在干旱脅迫下，對經(jīng)過外源濃度為20mg/L的8'-（C2H）ABA和ABA處理過的高羊茅植物進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過外源8'-（C2H）ABA和ABA處理過的高羊茅植物相比未經(jīng)處理的高羊茅，均能明顯降低相對電導(dǎo)率，說明外源8'-（C2H）ABA與ABA一樣，能夠有效地增強高羊茅植物在干旱脅迫下的抗旱能力。

光合作用是植物生長發(fā)育的主要物質(zhì)能量來源，植物要進(jìn)行光合作用，葉綠素是必不可少的，其含量的高低嚴(yán)重影響著光合作用的效率，對植物光合作用具有重要意義。葉綠素含量能在一定程度上反應(yīng)植株光合能力的強弱，而光合作用的強弱會直接影響植株生物量積累的多少。MDA 含量的高低反映了細(xì)胞膜脂過氧化的強弱和脂膜破壞程度，而抗氧化酶活性的高低是細(xì)胞抗逆能力的強弱指標(biāo)之一。植物體內(nèi)清除 ROS的SOD、POD 和 CAT這三種酶能夠防御活性氧自由基對細(xì)胞膜的傷害，抑制膜脂過氧化。本研究中，在干旱條件下，8'-（C2H）ABA與ABA處理后的高羊茅葉綠素含量增加，使光合能力增強，長勢更佳，生物量得以增加；同時高羊茅植株細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性顯著增強，明顯抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS含量的積累，防止膜脂過氧化，使得細(xì)胞中MDA的含量下降，從而減輕了細(xì)胞膜脂過氧化損傷程度，這些變化使高羊茅能更好地適應(yīng)干旱環(huán)境，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致。將8'-（C2H）ABA與ABA對比發(fā)現(xiàn)，8'-（C2H）ABA與ABA效果一致，同樣能夠增強高羊茅適應(yīng)干旱能力。

4 結(jié)論

本實驗研究了在干旱脅迫的條件下，通過PEG模擬干旱脅迫的方法，外源施加一定濃度的8'-（C2H）ABA和ABA對高羊茅抗旱能力的影響。在干旱脅迫下，通過葉面噴施8'-（C2H）ABA能夠提高高羊茅葉片中過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性、增加可溶性蛋白質(zhì)含量、降低丙二醛（MDA）和超氧陰離子（O2—）含量以及降低相對電導(dǎo)率、提高葉片相對含水率和葉綠素含量等，明確外源8'-（C2H）ABA提高高羊茅抗旱性的生理機(jī)制，為減輕干旱對高羊茅的危害、增強高羊茅的耐旱性提供理論依據(jù)。通過與ABA進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，8'-（C2H）ABA穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低，且具有與ABA在增強高羊茅抗旱性方面相似的效果，能夠在植物抗干旱方面作為ABA的替代物進(jìn)行進(jìn)一步研究和應(yīng)用。