腸道分節(jié)絲狀菌對宿主腸黏膜免疫系統(tǒng)的影響及其在模式動物中的研究進展

鐘奇祺，張海波，黎力之，廖曉鵬，關(guān)瑋琨*，郭冬生*

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，宜春市功能農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，江西宜春 336000；2.宜春學(xué)院繼續(xù)教育學(xué)院，江西宜春 336000）

腸道分節(jié)絲狀菌（Segmented filamentous bacteria，SFB）自1849 年被發(fā)現(xiàn)并取名為“enteric flora”后，采用16S rRNA 基因序列分析法進行鑒定證實其為不同于梭菌亞屬的一個新亞屬，命名為“Segmented filamentous bacteria[1-2]。SFB 作為回腸末端優(yōu)勢菌，也是最早被報道對宿主先天性免疫和固有性免疫同時產(chǎn)生影響的腸道菌[3]。研究表明SFB 定植對動物腸黏膜免疫建立及腸道環(huán)境調(diào)控具有重要意義，一方面SFB通過向外伸出獨特鉤狀結(jié)構(gòu)與腸上皮細胞（Intestinal Epithelial Cells，IECs）緊密結(jié)合，使抗原借道IECs向CD4+T 細胞呈遞，刺激其向輔助性T 17（T Helper 17，Th17）細胞分化，完善腸內(nèi)免疫機制[4-5]；另一方面，Th17 細胞所產(chǎn)生白細胞介素（Interleukin，IL）-17 與IL-22 協(xié)同促進β-防御素2 表達，保證腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整性[6]。此外，SFB 促進IgA+B 細胞增殖，同時腸腔IgA 也高效作用于SFB 與IECs 結(jié)合位點，防止SFB 異常擴增，所以腸道SFB 與IgA 產(chǎn)生存在反饋調(diào)節(jié)[7-8]。目前關(guān)于SFB 與宿主腸黏膜免疫系統(tǒng)間相互作用的系統(tǒng)綜述較為缺乏。因此，本文基于SFB 最新研究進展，重點闡述SFB 與Th17 細胞、IgA+B 細胞和固有淋巴細胞（Innate Lymphoid Cells，ILCs）的互作關(guān)系，并就SFB 在模式動物中的研究進行綜述，為指導(dǎo)動物健康養(yǎng)殖提供理論參考依據(jù)。

1 SFB 簡介

1.1 SFB 形態(tài)及生命周期 SFB 定植時形態(tài)發(fā)生改變，產(chǎn)生鉤狀突起作為細絲伸長點助力錨定，選擇性黏附于宿主IECs[9]。SFB 附著IECs 后，細絲向遠端生長分裂，隨長度增長菌體內(nèi)壁逐漸增厚至形成4 層細胞壁，同時中部開始內(nèi)陷逐漸靠攏形成隔，將內(nèi)膜包被小體分成不對稱兩小節(jié)，稱為次級未分化細胞[10]。一旦次級未分化細胞分化為子細胞與母細胞，母細胞便將子細胞吞噬容納，子細胞在其中又將分化為2 個細胞后代，隨細絲擴散或形成孢子釋放[11]。在適宜條件下，菌體內(nèi)陷隔便降解形成管狀結(jié)構(gòu)，將細胞運送至宿主腸道內(nèi)分散定植，開始新一輪黏附增殖；但非適宜條件時，后代細胞在母細胞內(nèi)包裹肽聚糖后變?yōu)樵撍拗鲀?nèi)缺乏定植能力的內(nèi)生孢子，隨糞便排出，直至外界適宜條件出現(xiàn)，水平傳播給下一宿主，完成SFB 生命周期[12]。

1.2 SFB 代謝特征 對小鼠和大鼠SFB 分離物進行基因組測序后，發(fā)現(xiàn)皆為1.5～1.62 Mbp 的小基因組，含1 350～1 400 個蛋白質(zhì)編碼基因和低水平的G+C，序列內(nèi)容與梭狀芽胞桿菌屬高度相似，二者最大區(qū)別在于糖利用途徑不同[13]。SFB 基因組具有非氧化戊糖磷酸和葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸糖酵解途徑的完整基因，但缺少有氧呼吸所必需的三羧酸循環(huán)途徑的絕大多數(shù)基因[14]。當(dāng)腸上皮表面SFB 定植位點上出現(xiàn)低氧時，SFB 將啟動精氨酸酶與過氧化氫酶基因的表達，形成自我保護[10]。研究證實，SFB 存在極嚴(yán)重的營養(yǎng)缺陷，喪失幾乎所有氨基酸（除賴氨酸）、維生素及輔酶因子的合成能力，完全依賴生存環(huán)境的供給維持自身[15]。此外，SFB 對鐵的需要量異常強烈，其自身無法合成鐵載體，但SFB可編碼3 種鐵攝取調(diào)節(jié)劑驅(qū)動周圍細菌的鐵載體，控制其他細菌中鐵含量[16]。因此，SFB 代謝對腸內(nèi)環(huán)境存在高度依賴性，印證其對IECs 緊密黏附的必要性，而這樣的黏附作用又在SFB 抗原呈遞刺激腸道免疫建立時發(fā)揮重要作用。

2 SFB 與動物腸黏膜免疫細胞的互作

2.1 SFB 與腸內(nèi)Th17 細胞的互作 在抗原刺激下固有層CD4+T 細胞特異性增殖分化為Treg 細胞、濾泡輔助性T 細胞和Th17 細胞等不同亞群[17]。轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體的相關(guān)孤立受體γt 分泌IL-17A、IL-17F 和IL-22為Th17 細胞出現(xiàn)的特征，Th17 細胞出現(xiàn)后可有效保護宿主免受細菌和真菌感染，維持腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)[18-19]。研究證實，SFB 陽性小鼠腸內(nèi)Th17 細胞數(shù)量及IL-17水平顯著高于SFB 陰性小鼠，可知SFB 影響Th17 細胞增殖及IL-17 分泌量[20-22]。SFB 不僅能生成特異性產(chǎn)物，對抗原呈遞方式也存在選擇。Goto 等[23]為證明SFB 誘導(dǎo)Th17 細胞增殖對主要組織相容性復(fù)合體 II（Major Histocompatibility Complex-II，MHC-II）的 依賴性，選用H2-Ab-/-小鼠（存在MHC-II 缺陷）移植野生型小鼠的CD4+T 細胞和SFB 菌株，結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)存在高水平CD4+T 細胞，SFB 成功定植腸道，Th17細胞數(shù)量卻明顯低于野生型小鼠。探究MHC-II 各類表達細胞后，發(fā)現(xiàn)除CD11c+細胞外小鼠腸內(nèi)樹突狀細胞（Dendritic Cells，DCs）不同亞群（CD11b+CD103+、CD11b-CD103+等）的耗竭對固有層中Th17 細胞水平不造成影響[22,24]。由此可見，腸道DCs 的MHC-II基因表達對于SFB 介導(dǎo)的Th17 細胞增殖具有重要作用。Yi 等[25]分別將源于大鼠和小鼠的SFB 定植于無菌小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠來源的SFB 促進Th17 細胞分化能力遠低于小鼠，后續(xù)試驗表明，其定植結(jié)果與缺乏黏附能力的SFB 變異株一致，說明SFB 的黏附能力是觸發(fā)宿主CD4+T 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。SFB 伸出鉤狀結(jié)構(gòu)與IECs 產(chǎn)生緊密連接，出現(xiàn)獨特的微生物黏附引發(fā)的內(nèi)吞作用（Microbial Adhesion Triggered Endocytosis，MATE），更利于抗原捕獲進行抗原呈遞[21]。MATE 形成特有囊泡結(jié)構(gòu)以獲取SFB 細胞壁上以蛋白P3340 為主的抗原物質(zhì)進入IECs，通過IECs 內(nèi)體-溶酶體網(wǎng)絡(luò)運送至細胞基底層，誘使血清淀粉樣A 蛋白（Serum Amyloid A，SAA）產(chǎn)生，其中SAA1 與SAA2 高度表達作用于固有層CD11c+細胞，提高IL-6 和IL-23 分泌量，刺激幼稚CD4+T 細胞向Th17 細胞方向分化[21,26]。綜上所述，SFB 利用獨特黏附作用定植于宿主IECs，特異選擇抗原呈遞方式，誘導(dǎo)機體Th17 細胞增殖，維持黏膜穩(wěn)態(tài)（圖1）。SFB 可促進動物Th17 細胞增殖，加強宿主對致病菌及SFB 本身的防御。研究表明，IL-17 受體（IL-17 Repoter，IL-17R）可直接調(diào)控α-防御素、Nox1（一種NADPH 氧化酶）和多聚免疫球蛋白（Polymeric Immunoglobulin Receptor，pIgR）受體基因表達水平，是限制SFB 及其他病原菌異常擴增的關(guān)鍵因子之一，其中IL-17A、IL-17F 與IL-17R 結(jié)合后抑菌作用最為顯著[27-28]。研究證明，IL-17A 和CXCR2 依賴的中性粒細胞在SFB 及其他致病菌急速擴張時向回腸募集，致使SFB 及致病菌數(shù)量明顯降低，黏膜屏障完整性得以維持[26,29]。因此，SFB 與Th17 細胞的相互作用利于機體腸黏膜免疫防御建立，保障腸道健康，但SFB 異常擴增觸發(fā)IL-17R 作用后導(dǎo)致SFB 數(shù)量下降，是針對SFB 自身的反向調(diào)節(jié)，還是抑制其他病原菌增殖而引發(fā)的SFB 數(shù)量協(xié)同降低，需進一步求證。

圖1 SFB 與腸內(nèi)Th17 細胞的互作

2.2 SFB 與IgA+B 細胞的互作 分泌型免疫球蛋白（Secretory Immunoglobulin A，sIgA）釋放主要發(fā)生在派爾集合淋巴結(jié)（Peyer's Patches，PPs）。將單定植SFB 或大腸桿菌的小鼠進行對比，發(fā)現(xiàn)兩類小鼠PPs 數(shù)量差別不大，但是SFB 定植小鼠出現(xiàn)明顯較大的PPs 生發(fā)中心，產(chǎn)生高濃度誘導(dǎo)配體（Proliferation Inducing LIgAnd，APRLI）和B 細胞活化因子（B Cell Activating Factor，BAFF），B220+IgA+B 細胞水平在細菌定植20 d 后激增達到頂峰，刺激宿主淋巴濾泡和三級淋巴組織形成，糞便sIgA 濃度與活性均顯著提高[30-31]。此外，除誘導(dǎo)IgA 產(chǎn)生外，SFB 還促使IECs 中pIgR 釋放，利于IgA 通過上皮進入腸腔發(fā)揮作用[32]。

SFB 誘導(dǎo)產(chǎn)生IgA 存在負反饋調(diào)節(jié)，防止SFB 過度定植[15]。Macpherson 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，腸道B 細胞缺乏IgA 類抗體轉(zhuǎn)化開關(guān)——胞嘧啶核苷脫氨酶（Activationinduced Cytidine Deaminase，AID），且IgM合成不受影響時，小鼠腸道內(nèi)SFB 異常迅速擴增，進行重組IgA 反應(yīng)后B220+IgA+B 細胞數(shù)目回到正常水平，隨后SFB 數(shù)量急劇下降，表明只有IgA 能夠解開SFB與IECs 的附著，而IgM 并不可以。腸腔IgA 將SFB高度包被，抑制其直接接觸腸壁，無法黏附IECs，失去定植能力，維持機體腸道屏障的完整性，抵御其他病原微生物入侵[32]。綜上，SFB 誘導(dǎo)產(chǎn)生IgA 可協(xié)助腸道環(huán)境穩(wěn)定，維護機體健康（圖2），但其對SFB 的作用如何異于其他免疫球蛋白仍需進一步探究。

圖2 SFB 與IgA+B 細胞的互作

2.3 SFB 與ILCs 的互作 ILCs 是參與宿主固有免疫反應(yīng)的淋巴細胞，分為ILC2、ILC3 等，常見于黏膜屏障部位，局部微環(huán)境改變后，接收免疫應(yīng)答信號分子（如IL-7、IL-23 等），促使細胞因子（如IL-22、INF-γ）及其他介質(zhì)分泌，產(chǎn)生免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用，其中ILC3 被認為是腸道IL-22 的主要分泌者[32,34]。IL-22 能有效刺激巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2 表達和上皮巖藻糖基化，誘導(dǎo)IECs 衍生抗微生物分子（如RegIIIγ、抗菌肽等），抵御病原菌入侵上皮系統(tǒng)，維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)[35-37]。SFB 誘導(dǎo)IL-22 是通過其定植后產(chǎn)生IL-23 間接進行，IL-23R 在ILC3 上發(fā)出信號，釋放IL-22，故IL-23R/IL-22 軸系出現(xiàn)缺陷導(dǎo)致SFB 異常增殖[38]。研究表明，將大鼠SFB 定植于缺乏SFB 的小鼠后，IL-22 恢復(fù)正常水平，揭示SFB 促進ILC3 釋放IL-22。

ILC3 通過依賴STAT3 的IL-22 信號觸發(fā)SAA 釋放，增強Th17 細胞分化，對SFB 定植產(chǎn)生影響。研究顯示，將SFB 定植于芳香烴受體缺陷小鼠，ILC3 基本生物學(xué)功能無法維持，導(dǎo)致IL-22 水平降低，SFB 數(shù)量異常增加，促使Th17 細胞增殖[42]。但Zhu[43]指出，ILC3 和IL-23R/IL-22 軸系抑制Th17 細胞反應(yīng)，這與軸系限制共生細菌誘導(dǎo)特異性CD4+T 細胞反應(yīng)的能力有關(guān)。因此，SFB 通過Th17、IECs 和IL-23R/IL-22 軸系等組成的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)對ILCs 產(chǎn)生作用，那么深入探究各細胞和因子間關(guān)系，可為進一步揭示SFB 影響ILCs 的分子機制提供理論依據(jù)。

3 SFB 在模式動物腸道免疫中的研究現(xiàn)狀

SFB 定植后具有抵御鼠傷寒沙門氏菌和檸檬酸桿菌入侵宿主的能力[44-45]。Lai 等[46]對不同年齡的小鼠腸道進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，SFB 定植的腸段不再出現(xiàn)沙門氏菌，SFB 未定植的部位發(fā)現(xiàn)沙門氏菌，同時將SFB 移植至感染腸致病性大腸桿菌O103（enteropathogenic Escherichia coli 103，REPEC O103）的家兔模型發(fā)現(xiàn)，SFB 穩(wěn)定存在后REPEC O103 無法引起相應(yīng)病癥。腸道SFB 不僅幫助動物抵抗病原菌侵襲，還增強動物防御腸道寄生蟲的能力。Burgess 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，痢疾變形蟲感染SFB單定植小鼠模型后，其腸內(nèi)中性粒細胞數(shù)量顯著上升，使宿主免受侵害。Edelblum 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲感染小鼠在SFB 定植后觸發(fā)腸道通透性補償增加，產(chǎn)生大量IL-17A 抑制病原體易位。SFB 異常擴增可介導(dǎo)產(chǎn)生劇烈的Th17 反應(yīng)，誘使IL-17 過度產(chǎn)生觸發(fā)炎性腸病[48]。Jia 等[49]試驗顯示，葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠體內(nèi)IL-17A、SFB 含量激增，使用蛋殼膜粉治療后，SFB 數(shù)量顯著降低，菌群多樣性恢復(fù)，抑制Th17 細胞過度表達，有效緩解結(jié)腸炎。此外，小鼠患重度聯(lián)合免疫缺陷癥移植CD4+T 細胞恢復(fù)后，將SFB+SPF 菌群混養(yǎng)定植腸內(nèi)才能誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎，并伴隨SFB 數(shù)量增多；而SFB 單定植一段時間后數(shù)量下降，SPF 菌群定植卻未出現(xiàn)病理變化，表明SFB 異常擴增導(dǎo)致結(jié)腸炎，且依賴腸內(nèi)其他共生菌產(chǎn)生輔酶因子（乙酰輔酶A、核黃素等）維持自身需要[25]。綜上所述，SFB 定植于模型動物腸道對提高腸道菌群豐富度、阻止病原體危害宿主、維持腸道免疫具有重要意義，但SFB的異常增殖也會導(dǎo)致機體發(fā)生腸道炎癥，調(diào)控SFB 水平可為未來治療腸道炎癥提供新方向。

4 結(jié) 語

SFB 定植在模式動物試驗中被證實與腸黏膜免疫具有積極的互作效應(yīng)，主要與Th17 細胞、IgA+B 細胞及ILCs 發(fā)生作用。錨定于IECs 上的SFB，向Th17 細胞抗原呈遞，促使IL-17 分泌，阻止病原菌入侵上皮，同時IL-17R 的調(diào)控作用使腸內(nèi)SFB 水平保持穩(wěn)定，維持良好的腸道環(huán)境。SFB 刺激IgA+B 細胞增殖，使腸內(nèi)sIgA 維持較高水平，可特異解除過度增殖SFB 對IECs的黏附，反向控制SFB 定植，并靶向清除其他致病菌，進而預(yù)防疾病發(fā)生。此外，SFB 可間接促進ILC3 分泌IL-22，完善IL-23R/IL-22 軸系，加速腸黏膜免疫系統(tǒng)的建立。然而，腸道免疫為一復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在SFB與宿主交互作用下對免疫是否造成其他影響尚無定論，故利用更為全面的分析手段深入探討SFB 對動物體作用的分子機制，更有助于確定其在維護腸道健康和疾病預(yù)防方面的有益作用，為指導(dǎo)動物健康養(yǎng)殖提供理論參考依據(jù)。現(xiàn)有的研究成果顯示，SFB 獨特的黏附方式是其與動物體發(fā)生積極互作效應(yīng)的基礎(chǔ)，但SFB 菌株具有多樣性，不同動物間SFB 存在差異，且不同菌株定植能力有強弱之別，而目前多數(shù)研究仍集中進行于一類試驗動物上，關(guān)于畜禽SFB 的研究鮮有報道，因此建立SFB 體外分離純培養(yǎng)探究純培SFB 在其他動物體是否發(fā)揮相同作用為今后的研究方向之一，同時也需要更多基礎(chǔ)試驗為后續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。