吳巧群，許厚強(qiáng)，崔小芝，楊麗紅，諶穎蓮

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；5.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

MicroRNAs（miRNA）是由20～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA 小分子，其通過與靶mRNA 的3'-UTR端區(qū)域結(jié)合來抑制目的基因的翻譯或降解目的基因[1]，從而參與動(dòng)物、植物、病毒、細(xì)菌[2-5]中多種生理或病理過程的調(diào)控。隨著對(duì)miRNA 的深入了解，牛[6]、羊[7]、豬[8]等家畜也不斷被作為研究對(duì)象，目前miRNA 在豬方面的研究主要集中在對(duì)脂肪、肌肉、生殖系統(tǒng)以及疾病的發(fā)生發(fā)展方面，但當(dāng)中的具體調(diào)控機(jī)制還有待研究。對(duì)miRNA 的研究方法主要通過高通量測(cè)序、微陣列芯片、RT-qPCR 等技術(shù)來提高檢測(cè)的特異性與靈敏度[9]，雖然軟件的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性不斷提高，可仍需要實(shí)驗(yàn)手段才能得以驗(yàn)證。從江香豬屬于地方型豬種，具有肉質(zhì)細(xì)嫩、抗病性強(qiáng)、基因純合度高等特點(diǎn)，但該豬種體型矮小，生長(zhǎng)緩慢[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA1基因在從江香豬各組織中均有表達(dá)且在肺組織的表達(dá)量最高[11]。吳小敏通過在線軟件篩選出PRKAA1基因相關(guān)的2 條LncRNAs，分別是ALNCI 和ALNC2，并通過構(gòu)建相應(yīng)真核表達(dá)載體干擾、熒光定量PCR 以及檢測(cè)蛋白等證實(shí)這2 個(gè)LncRNAs 可促進(jìn)脂肪形成和脂肪前體細(xì)胞分化[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)以PRKAA1基因?yàn)檠芯勘尘?，篩選相應(yīng)miRNAs，研究篩選出的miRNA 對(duì)從江香豬生物機(jī)制的調(diào)控。為了研究差異表達(dá)miRNAs 的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)篩選出多個(gè)miRNAs 后，選取表達(dá)量相對(duì)較高的miRNA-143-3P 為研究對(duì)象，了解該miRNA 在從江香豬組織中的表達(dá)規(guī)律，為后期研究miR-143-3P對(duì)從江香豬生長(zhǎng)和生物功能的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 在貴州大學(xué)種豬場(chǎng)采集2 月齡從江香豬的胃、大腸、舌、腦、腎、肝、肺、脾、小腸各組織樣30 g，分裝放入液氮中，隨后將其轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 普通PCR 儀（Bio-Rad）、CFX-96熒光定量PCR 儀（Bio-Rad）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。pMD-19-T 載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；2×EsTaq Master Mix 購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DM 2000 Marker 購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司；Trizol 試劑購(gòu)自英駿生物技術(shù)有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、75%的酒精購(gòu)自宏達(dá)爾生物科技有限公司；超微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 miR-143-3P 的預(yù)測(cè) 根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中豬的PRKAA1基因（登錄號(hào)：XM-0210 76522）3'-UTR 端序列，利用R 軟件（http://cran.r-project.org）編寫SWChen 2.3 程序以Simth-Waterman 算法預(yù)測(cè)出候選的miRNAs，將預(yù)測(cè)的結(jié)果與高通量測(cè)序的部分結(jié)果運(yùn)用在線軟件Venny2.1 做韋恩圖取三者交集，選出表達(dá)量相對(duì)較高的miRNAs。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找豬的miR-143-3P 序列（登錄號(hào)：NR_038529.1），采用莖環(huán)法設(shè)計(jì)引物選取特異性莖環(huán)用于逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物合成均由生工生物工程股份有限公司完成。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 從江香豬miR-143-3P 序列克隆 根據(jù)Trizol 試劑盒說明書提取從江香豬胃、大腸、舌、腦、肺、腎、肝、脾、小腸組織的總RNA，將各樣本RNA 進(jìn)行濃度測(cè)定。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反應(yīng)體系為20 μL。第一步，在無酶的PCR 管中加入1 μL 的DNA 酶，10×RT Buffer 1 μL，各RNA 樣與水共加8 μL，共10 μL，放入PCR儀中37℃ 2 min，55℃ 5 min。第二步，加入莖環(huán)引物1 μL，內(nèi)參下游1 μL，dNTP Μixture 1 μL，再加水2 μL，65℃ 5 min。第三步，加入5×RT Buffer 4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶加1 μL，25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min。以脾臟的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL（10 mmoL），2×EsTaq Μaster Μix 10 μL，加水7 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，退火59℃ 30 s，25 個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，與maker 比對(duì)，將與目的條帶相近的部分進(jìn)行膠回收，再與pMD-19-T 載體連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐板中挑選出陽(yáng)性菌落，送至生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 miR-143-3p 序列保守性分析 利用MegAlign 軟件將miR-143-3P 的成熟序列與人（Homo sapiens，hsa）、豬（Sus scrofa，sus）、山羊（Capra hircus，chi）、小鼠（Mus muscμLus，mmu）、鯉魚（Cyprinus carpio，ccr）、馬（Equus caballus，eca）、雞(Gallus gallus，gga)、牛（Bos taurus，bta）的前體序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將逆轉(zhuǎn)錄各組織的cDNAs 進(jìn)行Real-time qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL：2×ΜLtra SYBR Mixture（High ROX）5 μL，上下游引物各1.5 μL（10 mmoL）、cDNA 1 μL、水1 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，59℃退火45 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品都有3 個(gè)重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用2-ΔΔCt公式計(jì)算，用SPSS19.0 軟件分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)表示差異顯著，P<0.01 時(shí)表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 靶基因的預(yù)測(cè) 利用R 軟件編寫SWChen 2.3 程序以PRKAA1 基因3'-UTR 端篩選出的miRNAs 選取803個(gè)，再以miRNA 的種子區(qū)篩選出825 個(gè)，選取高通量測(cè)序部分結(jié)果中的40 個(gè)，利用Draw Venn Diagram 在線（http://bioinformatics.psb.ugent.be）軟件選取三者（圖1）共有的8 個(gè)miRNAs，其中包含有miR-143-3P。

圖1 以PRKAA1 的3'-UTR 預(yù)測(cè)的miRNAs 交集結(jié)果

2.2 從江香豬miR-143-3P 的克隆及保守性分析 以從江香豬脾臟的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，成功克隆出從江香豬miR-143-3P 序列，擴(kuò)增總長(zhǎng)度為88 bp（圖2），測(cè)序結(jié)果比對(duì)也完全一致（圖3），其中miR-143-3P 的序列長(zhǎng)度為21 bp。

圖2 從江香豬miR-143-3P 克隆菌液PCR 結(jié)果

MegAlign 軟件對(duì)從江香豬miR-143-3P 成熟序列與不同物種間的同源性分析結(jié)果如圖4 所示，從江香豬中miR-143-3P 的成熟序列與山羊、牛、人、鯉魚、豬、馬、雞、小鼠前體miRNA-143 的序列相似性都是100%。

2.3 miR-143-3P 在從江香豬各組織中的表達(dá)差異 由圖5可知，熔解曲線峰值單一，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用。檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，miR-143-3P 在從江香豬各組織中均有表達(dá)，其中在肝中表達(dá)量最高，在舌組織中表達(dá)量最低；在肝、胃、脾、肺、小腸中表達(dá)量均極顯著高于大腸、舌、腦、腎（P<0.01）；在肺和小腸中表達(dá)差異不顯著（P>0.05）；在舌、腦、腎之間的表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。

3 討 論

圖3 從江香豬miR-143-3P 測(cè)序結(jié)果圖

圖4 miR-143-3P 成熟序列與不同物種miRNA-143 的前體序列比對(duì)

近年來，越來越多的研究表明miRNA 參與動(dòng)物的基本生理功能，例如在冷應(yīng)激下，大鼠肝臟中的miRNA-383、miRNA-92a 表達(dá)有極顯著升高[13]，在奶牛熱應(yīng)激中miRNA-19a 與miRNA-19b 都參與了調(diào)控[14]；miRNA 還參與了豬生殖器官的發(fā)育，如Wright 等[15]證實(shí)了miRNA-21 表達(dá)會(huì)影響卵母細(xì)胞的成熟率；miRNA 還參與了絨山羊絨毛的生長(zhǎng)，在絨毛生長(zhǎng)的不同時(shí)期，miRNA-1298-5P 具有差異性表達(dá)，還可通過負(fù)調(diào)控TGF-βRI基因?qū)q山羊絨毛的生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)絨毛生長(zhǎng)[16]。這些都體現(xiàn)出miRNA 在動(dòng)物機(jī)體中參與的調(diào)控較多，起重要作用。從江香豬的肌內(nèi)脂肪含量高于大白豬[17]，肌內(nèi)脂肪含量又是影響肉質(zhì)品質(zhì)的重要因素，有研究表明miRNA 能夠調(diào)控豬脂肪代謝[18]，由此推測(cè)miRNA 可能參與從江香豬生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

研究動(dòng)物的miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件較多，有TargeScan、RNAhybrid、MiRBase、miRTarBase、miRWalk 等，但這些軟件也可通過某個(gè)具體基因來預(yù)測(cè)相應(yīng)的miRNAs，預(yù)測(cè)機(jī)制各有不同，有通過基因的3'-UTR 與軟件數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNAs 靶向結(jié)合來預(yù)測(cè)[19]，也有通過基因與miRNA 之間形成二聚體來預(yù)測(cè)基因的miRNAs[20]。這些軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果都存在著假陽(yáng)性，應(yīng)結(jié)合多個(gè)軟件預(yù)測(cè)，取交集選用共有的miRNAs 或靶基因來減少假陽(yáng)性。

miR-143 為廣泛性表達(dá)的基因，該miRNA 與肉品質(zhì)以及代謝多方面的調(diào)控作用存在密切聯(lián)系，所以一直都是研究熱點(diǎn)。為了解miR-143-3P 在從江香豬的表達(dá)規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)以從江香豬中脾臟的cDNA 為模板成功克隆出miRNA-143-3P 的成熟序列，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與人、豬、鼠、牛、馬、鯉魚、雞、山羊的前體序列完全一致，這說明miR-143-3p 序列在各物種間為高度保守，與高玲玲[21]研究has-miR-143、趙冉[22]研究廣西巴馬小型豬miR-143-5p 的保守性一致，這提示了該基因在生物學(xué)功能的相似性和重要性。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因在從江香豬的9 個(gè)組織中均有表達(dá)，且表達(dá)水平存在差異，其中在肝、脾、胃中的表達(dá)高于其他組織。miR-143-3P 在從江香豬各組織的表達(dá)水平與李東偉[23]、張曉東[24]等人分別在牛、白山羊中的研究結(jié)果不同，以往研究顯示在肝臟中的表達(dá)量較低，在脾臟與胃的表達(dá)量豐富；與云青[25]在長(zhǎng)白豬的研究存在差異，該研究中的miRNA-143-3P 在心臟表達(dá)水平高，其次是肝臟，而在脾臟中的表達(dá)量較低。進(jìn)一步證實(shí)了miRNA 的表達(dá)水平在不同物種、不同品種動(dòng)物中的同一組織存在較大差異[26]，導(dǎo)致這樣結(jié)果的原因可能與各器官在不同品種中的功能性強(qiáng)弱有關(guān)。這也提示了miRNA-143-3P 可能在從江香豬肝臟中的發(fā)育及功能發(fā)揮中起重要作用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過PRKAA1基因3'-UTR 成功篩選出相關(guān)miR-143-3P，以從江香豬的脾cDNA 為模板成功克隆出miR-143-3P 序列，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)出該miRNA 在各組織中均有表達(dá)，且在肝中的表達(dá)量最高，其次是胃與脾；對(duì)miR-143-3P 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示miRNA 具有較高的保守性。