miR-18b-3p 靶向SCD 調(diào)控綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的研究

王家麒，韓?；郏w 樂(lè)，賀建寧，周李生，李蘭蘭，柳 楠

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

羊肉因其蛋白含量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富越來(lái)越受到消費(fèi)者歡迎，羊肉的口感和風(fēng)味受肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）含量影響[1]。動(dòng)物的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞是由間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化形成前體脂肪細(xì)胞，進(jìn)而在某些基因及通路的調(diào)控下分化為脂肪細(xì)胞[2-3]。miRNA 作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，已經(jīng)被證明參與脂肪代謝和細(xì)胞分化等進(jìn)程[4]。如miR-143 可以促進(jìn)牛成纖維樣脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞[5]，miR-27a 調(diào)控RXRα基因抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化[6]。然而，關(guān)于miRNA 在調(diào)控綿羊肌內(nèi)脂肪中的作用研究仍然較少，探索miRNA在綿羊肌內(nèi)前體脂肪分化中的調(diào)控作用將對(duì)改善肉品質(zhì)具有重大意義。

目前，關(guān)于miR-18b 的研究多集中于人類疾病。Murakami 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-18b 通過(guò)靶向TNRC6B基因來(lái)抑制肝細(xì)胞癌分化。Naml?s 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，從成骨細(xì)胞到骨肉瘤，再到骨骼，miR-18b 的表達(dá)量與細(xì)胞分化程度呈反比，這表明miR-18b 可能是細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。Sun 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-18b-3p 可以通過(guò)靶向ACOT13充當(dāng)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的抑制劑，但是miRNA-18b-3p 是否對(duì)綿羊肌內(nèi)脂肪的形成產(chǎn)生調(diào)控作用沒(méi)有研究。硬脂酰輔酶A 去飽和酶（SCD）是催化單不飽和脂肪酸形成的限速酶，通過(guò)影響脂肪酸的比例調(diào)控脂質(zhì)代謝，在家畜的乳脂品質(zhì)及脂肪沉積中研究廣泛[10]。

本研究通過(guò)生信軟件預(yù)測(cè)到miRNA-18b-3p 與SCD 存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，以分離獲得的敖漢細(xì)毛羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)miR-18b-3p 在細(xì)胞分化過(guò)程中的作用進(jìn)行研究，從分子水平上為綿羊選擇肉品質(zhì)性狀提供參考，為加快肉毛兼用型細(xì)毛羊的選育給予分子育種技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取1 只3 日齡的健康敖漢細(xì)毛羊羔羊用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 II 型膠原酶、TRIzol、無(wú)RNA 酶ddH2O等（青島賽尚試劑有限公司）；PBS（Cytiva 公司）；胎牛血清（FBS，Gibco 公司）；牛胰島素（INS）、油紅O 染液等（北京索萊寶有限公司）；異丁基-甲基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）等（Sigma 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒等（青島艾科瑞生物有限公司）；miR-18b-3p 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司）；蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、5×上樣緩沖液、蛋白 Marker 等（南京諾唯贊生物股份有限公司）；抗體（Proteintech 公司）；載體、轉(zhuǎn)染試劑GP-transfect-Mate（上海吉瑪生物有限公司）；雙熒光素酶載體psi-CHECK2、Dual-Luciferase system 試劑盒（Promega 公司）。

1.3 綿羊前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng) 用無(wú)菌的剪刀、鑷子取3 日齡羔羊背最長(zhǎng)肌，用含有雙抗（青霉素和鏈霉素）的無(wú)菌PBS 溶液沖洗數(shù)遍，在超凈臺(tái)內(nèi)除去明顯可見(jiàn)的血管以及結(jié)締組織，將肌肉充分剪碎放入離心管中，加入II 型膠原酶，緩慢吹打，37℃震蕩充分消化成絮狀約1.5 h，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化后，用200目過(guò)濾篩過(guò)濾，離心后重懸細(xì)胞，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)液。

1.4 綿羊前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 將原代分離的細(xì)胞進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞密度接近80%時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，觀察細(xì)胞狀態(tài)為明顯接觸抑制時(shí)，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基（組成為DΜEΜ+0.5 mmol/L IBΜX+1 μmol/L 地塞米松+10 μg/mL胰島素+10% FBS+1%雙抗），此時(shí)記為0 d，培養(yǎng)2 d；換用維持培養(yǎng)基（DΜEΜ+10 μg/mL 胰島素+10% FBS+1%雙抗）分化2 d；然后用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞基本分化為脂滴。從0 d 開(kāi)始每2 d 收集一次細(xì)胞。

1.5 油紅O 染色 使用含雙抗的PBS 清洗細(xì)胞后，加入細(xì)胞固定液；加入60% 異丙醇浸洗；在避光環(huán)境下將染色液A 與染色液B 按照3:2 的比例配制后，覆蓋細(xì)胞充分染色，水洗直到無(wú)多余染液；加入蒸餾水觀察脂滴染色情況。

1.6 miR-18b-3p 的靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用生信軟件TargetScan在線預(yù)測(cè)miR-18b-3p 的靶基因。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分化0、2、4、6、8 d 時(shí)，采用Trizol 提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)NanoDrop ND-2000儀器（Thermo Fisher Scientific）測(cè)定RNA 的純度和濃度。SCD、PPARγ、CEBPα基因反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA 總量為1 μg，定量程序設(shè)置：95℃ 3 min；40 個(gè)循環(huán)：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃20 s；72℃ 10 min 收集信號(hào)。以GAPDH為內(nèi)參基因；miR-18b-3p 按照Mir-X miRNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行。以U6 作為miR-18b-3p 的內(nèi)參基因。miRNA 定量程序設(shè)置：95℃ 10 min；45 個(gè)循環(huán)：95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s；72℃ 6 min 收集信號(hào)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞密度統(tǒng)一調(diào)整為2×105個(gè)，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度為70% 左右。轉(zhuǎn)染分為3 組，分別為過(guò)表達(dá)（miR-18b-3p mimics）組、抑 制（miR-18b-3p inhibitor）組、陰性對(duì)照組（miR-18b-3p NC），將DMEM 與轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻（A 液），將DMEM 與各組載體輕輕混勻（B 液），將A 液輕輕加入B 液中，室溫靜置15 min，此時(shí)將細(xì)胞用無(wú)雙抗PBS 清洗2 遍，完全清除血清后，每孔加入預(yù)熱的無(wú)雙抗培養(yǎng)基；向細(xì)胞中加入AB 混合液，放入培養(yǎng)箱約6 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，并更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.9 miR-18b-3p 對(duì)基因mRNA 水平的影響 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照1.3 中方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化，取分化2 d 的細(xì)胞，進(jìn)行總RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR，步驟同1.6。

1.10 miR-18b-3p 對(duì)SCD 蛋白表達(dá)量的影響 取轉(zhuǎn)染后分化2 d 的細(xì)胞，提取蛋白。將細(xì)胞用PBS 清洗后與蛋白裂解液混勻，靜置5 min 后用細(xì)胞刮輕輕刮取細(xì)胞，移入1.5 mL 離心管中，埋于冰內(nèi)裂解；12 000 r/min 離心5 min，取上清至離心管中，此時(shí)獲取的為總蛋白，通過(guò)蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，加入 5×上樣緩沖液平衡蛋白濃度，煮沸后置于-20℃?zhèn)溆?；依次配?0%分離膠、5%濃縮膠，凝固后將Marker 和所需樣品緩慢加入泳道；200 V 穩(wěn)壓，凝膠電泳1～2 h 后300 mA 冰浴70 min 轉(zhuǎn)PVDF 膜；用牛奶進(jìn)行封閉，2 h，40～50 r/min；室溫孵育一抗（1:2 000），2 h，40～50 r/min；用1×TBST在搖床清洗PVDF 膜，在避光環(huán)境下對(duì)二抗進(jìn)行孵育1 h（1:1 000）；PVDF 膜搖床清洗多次，加顯色液（A 液:B液=1:1），凝膠成像儀上進(jìn)行曝光。

1.11 雙熒光素酶驗(yàn)證靶向關(guān)系 首先將SCD基因mRNA 野生型（SCD-3’UTR-wt）和突變型（SCD-3’UTR-mut）擴(kuò)增至雙熒光素酶載體psi-CHECK2 中，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；將構(gòu)建好的目的質(zhì)粒與miR-18b-3p模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（mimics NC）共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染共分4 個(gè)組：miR-18b-3p mimics 與SCD-3’UTR-wt 共轉(zhuǎn)染，mimics NC 與SCD-3’UTRwt 共轉(zhuǎn)染，miR-18b-3p mimics 與SCD-3’UTR-mut共轉(zhuǎn)染，mimics NC 與SCD-3’UTR-mut 共轉(zhuǎn)染；在轉(zhuǎn)染約6 h 后給細(xì)胞換液，轉(zhuǎn)染48 h 后對(duì)細(xì)胞信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析 本研究中結(jié)果均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行，測(cè)定的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 前體脂肪細(xì)胞的分化形態(tài) 原代細(xì)胞培養(yǎng)4 d，可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量較多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖1-A）；為分化至4 d 時(shí)的狀態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)典型的脂環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1-B）；分化至6 d 時(shí)，視野下脂滴大量聚集（圖1-C）；分化至8 d 時(shí)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞已經(jīng)分化為大量脂滴，培養(yǎng)基表面呈油狀，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色，大面積脂滴被染為紅色（圖1-D），說(shuō)明前體脂肪細(xì)胞分化成功。

圖1 綿羊前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及分化驗(yàn)證

2.2 miR-18b-3p 的靶基因預(yù)測(cè) 使用TargetScan 對(duì)miR-18b-3p 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖2 所示，miR-18b-3p與SCD存在結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明miR-18b-3p 可能與SCD的3'UTR 相結(jié)合，SCD基因是miR-18b-3p 的潛在靶基因。

圖2 miR-18b-3p 與SCD 基因的靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.3 基因在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化時(shí)期的時(shí)序性表達(dá)如圖3 所示，miR-18b-3p 的表達(dá)先上升后下降，2 d 表達(dá)量高于0 d（P<0.01），6 d 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（P<0.01），8 d 時(shí)表達(dá)量下降；SCD基因的表達(dá)量與miR-18b-3p相似，但是2 d 與0 d 表達(dá)量差異不顯著，8 d 時(shí)表達(dá)量下降不顯著，但仍高于0、2、4 d 的表達(dá)量（P<0.01）。由圖4 可知，分化標(biāo)志基因PPARγ在分化過(guò)程中始終高表達(dá)，在4 d 時(shí)表達(dá)量高于其他時(shí)期（P<0.01），6 d 與8 d 的表達(dá)量差異不顯著；C/EBPα的表達(dá)趨勢(shì)與SCD基因相似，在4、6、8 d 時(shí)表達(dá)量始終高于0 d 和2 d的表達(dá)量（P<0.01）。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-18b-3p 對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化的作用如圖5 所示，轉(zhuǎn)染miR-18b-3p 過(guò)表達(dá)載體（mimics）后，miR-18b-3p 的表達(dá)量高于陰性對(duì)照組（P<0.01）；SCD基因在mRNA 及蛋白水平低于陰性對(duì)照組（P<0.01）。由 圖6 可 知，過(guò)表達(dá)miR-18b-3p 后，PPARγ及C/EBPα基因表達(dá)量低于陰性對(duì)照組（P<0.05）。綜上，miR-18b-3p 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功且顯著抑制了SCD與PPARγ及C/EBPα基因的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞分化。

圖3 綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中miR-18b-3p、SCD 基因的時(shí)序性表達(dá)

圖4 綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα 時(shí)序性表達(dá)

圖5 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體后miR-18b-3p 與SCD 基因的表達(dá)量

圖6 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體后標(biāo)志基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

2.5 抑制miR-18b-3p 對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化的作用 如圖7 所示，miR-18b-3p 抑制載體（inhibitor）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-18b-3p 表達(dá)量低于陰性對(duì)照組（P<0.01），而SCD基因mRNA 及蛋白表達(dá)量高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。由圖8 可知，相較于陰性對(duì)照組，抑制miR-18b-3p 的表達(dá)后，PPARγ表達(dá)量高于陰性對(duì)照組（P<0.05），而C/EBPα表達(dá)量高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。綜上表明，抑制miR-18b-3p 表達(dá)后，SCD、PPARγ及C/EBPα的表達(dá)量顯著提高。

2.6 miR-18b-3p 對(duì)脂滴生成的影響 分別轉(zhuǎn)染miR-18b-3p 過(guò)表達(dá)、抑制及陰性對(duì)照載體后，將細(xì)胞誘導(dǎo)分化至第8 天，觀察miR-18b-3p 對(duì)脂滴生成的影響。如圖9 所示，相較于miR-18b-3p NC 組，過(guò)表達(dá)miR-18b-3p 后，油紅O 染色面積極顯著減少，抑制 miR-18b-3p 后，油紅O 染色面積顯著增多。由此說(shuō)明，miR-18b-3p 可以顯著抑制脂滴的生成，即miR-18b-3p負(fù)向調(diào)控前體脂肪細(xì)胞的分化。

圖7 轉(zhuǎn)染抑制載體后miR-18b-3p 與SCD 基因的表達(dá)量

圖8 轉(zhuǎn)染抑制載體后分化標(biāo)志基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

圖9 miR-18b-3p 對(duì)脂滴生成的影響

2.7 miR-18b-3p 與SCD基因的靶向關(guān)系驗(yàn)證 為驗(yàn)證miR-18b-3p 與SCD基因是否具有直接靶向關(guān)系，本研究通過(guò)雙熒光素酶進(jìn)行測(cè)定。如圖10 所示，與mimics NC +SCD-3′UTR-wt 相 比，miR-18b-3p mimics+SCD-3’UTR-wt 的表達(dá)量降低（P<0.001），由此說(shuō)明，miR-18b-3p 與SCD基因發(fā)生了結(jié)合，抑制了SCD基因表達(dá)，從而使熒光素酶活性降低；與mimics NC +SCD-3′UTR-mut 相 比，miR-18b-3p mimics+SCD-3′UTR-mut的表達(dá)量無(wú)變化，說(shuō)明在SCD-3′UTR 發(fā)生突變后miR-18b-3p 無(wú)法與SCD相結(jié)合，對(duì)SCD基因的表達(dá)無(wú)調(diào)控作用。綜上說(shuō)明，miR-18b-3p 與SCD基因具有直接靶向關(guān)系。

圖10 miR-18b-3p 與SCD 基因的雙熒光素檢測(cè)

3 討 論

肌內(nèi)脂肪含量是肉品質(zhì)的關(guān)鍵決定因素，前體脂肪細(xì)胞的分化機(jī)制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1]。目前有關(guān)家畜前體脂肪細(xì)胞的分化研究大多使用皮下或尾部脂肪組織進(jìn)行原代分離[11]，如崔京京等[12]使用膠原酶I 消化綿羊腹股溝脂肪組織，消化1 h 后，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 細(xì)胞出現(xiàn)貼壁。本研究中使用膠原酶II 消化綿羊背最長(zhǎng)肌組織，消化時(shí)間約為1.5 h，在培養(yǎng)12 h 后細(xì)胞開(kāi)始貼壁。培養(yǎng)條件的差異說(shuō)明不同部位前體脂肪細(xì)胞的形成有所差異，因此本研究采集綿羊背最長(zhǎng)肌組織進(jìn)行肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)更有代表性。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞誘導(dǎo)分化至8 d 時(shí)顯微鏡視野下可見(jiàn)大面積的脂滴，細(xì)胞數(shù)量顯著變少，經(jīng)油紅O 染色后，脂滴被染為紅色，表明細(xì)胞分化成功。

PPARγ和C/EBPα相互合作，在脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸氧化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，缺失PPARγ基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在體外模型中無(wú)法分化為脂肪細(xì)胞[13]，因此在本實(shí)驗(yàn)選擇PPARγ和C/EBPα作為脂肪分化的標(biāo)志基因。本研究中，PPARγ基因在整個(gè)過(guò)程中持續(xù)高表達(dá)，在4 d 時(shí)達(dá)到最高，且在0～4 d 的表達(dá)量顯著高于C/EBPα，這與大多數(shù)研究結(jié)果相一致[14]。PPARγ處于脂肪細(xì)胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心位置，尤其在細(xì)胞分化早期發(fā)揮著重要作用[14]。C/EBPα基因在0～6 d 呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，6～8 d 時(shí)表達(dá)量較高，C/EBPα的表達(dá)能夠誘導(dǎo)其他成脂基因的表達(dá)，從而促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化。

近些年來(lái)，關(guān)于miRNA 在脂肪分化中的作用研究越來(lái)越深入，如miR-204、miR-103 及miR-21 可以促進(jìn)脂肪沉積，miR-130a、miR-155 及 miR-27a 等抑制脂肪沉積[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-18b-3p 在細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)量先上升后下降，0 d 時(shí)表達(dá)量低于8 d 時(shí)成熟脂肪細(xì)胞的表達(dá)量，但miR-18b-3p 在雞中0 d 時(shí)表達(dá)量高于10 d 細(xì)胞成熟時(shí)的表達(dá)量[9]，這可能與基因的物種差異性有關(guān)，但推斷miR-18b-3p 可能對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化具有一定的調(diào)控作用。在家畜體內(nèi)，SCD基因在豬、牛、綿羊中具有較好的保守性，主要催化不飽和脂肪酸的生成[10]。研究表明SCD基因在肥尾羊的尾部脂肪沉積中具有重要調(diào)控作用[16]。張海波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SCD基因可能促進(jìn)牦牛IMF 的沉積。丁芳[20]研究發(fā)現(xiàn)，SCD基因在鴨前體脂肪分化中緩慢上調(diào)，在分化后期達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)中，SCD基因表達(dá)量持續(xù)上調(diào)至6 d，8 d 時(shí)表達(dá)量下降但與6 d 差異不顯著，由此推斷SCD基因在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中可能具有促進(jìn)作用。除此之外，miR-18b-3p、SCD、PPARγ和C/EBPα的表達(dá)呈相似的變化趨勢(shì)。有研究表明，多種游離脂肪酸都是脂肪分化主調(diào)控因子PPARγ的天然配體[21]，因此推斷SCD可能與PPARγ、C/EBPα共同參與同一條調(diào)控通路，從而對(duì)脂質(zhì)沉積、代謝產(chǎn)生作用，接下來(lái)將對(duì)基因所參與的通路進(jìn)行深入研究。

為了進(jìn)一步研究miR-18b-3p 對(duì)SCD基因的調(diào)控作用，本研究分別轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)、抑制、陰性對(duì)照載體至前體脂肪細(xì)胞，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-18b-3p 后，分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα的表達(dá)量顯著降低，SCD基因mRNA 及蛋白表達(dá)量均降低；抑制miR-18b-3p 后，分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα的表達(dá)量顯著升高，靶基因SCDmRNA 及蛋白表達(dá)量均升高；通過(guò)雙熒光素酶證明了miR-18b-3p 對(duì)SCD基因具有直接調(diào)控作用。綜上結(jié)果表明，miR-18b-3p 可以通過(guò)靶向SCD抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞分化。這是首次在綿羊上證明miR-18b-3p 對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，可為肉羊分子育種提供一定理論參考。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，綿羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功；在細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-18b-3p 的表達(dá)量呈先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)；通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-18b-3p 的過(guò)表達(dá)及抑制載體證明了miR-18b-3p 調(diào)控SCD及分化標(biāo)志基因的表達(dá)并抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化；雙熒光素酶結(jié)果表明，miR-18b-3p 可以直接與SCD的3′UTR 相結(jié)合。綜上可知，miR-18b-3p 可以通過(guò)靶向SCD基因抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化。