四川道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)的分子檢測(cè)及中藥防治研究

李友英，藍(lán) 嵐，潘 瑤，楊丹嬌，吳建平，張康林，湯 承

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

0 引言

梨形蟲(chóng)病是反芻動(dòng)物中一種重要的蜱傳寄生蟲(chóng)病[1-2]。該病的臨床表現(xiàn)多樣，且多呈非特異性[3]，主要以貧血、黃疸、發(fā)燒、血紅蛋白尿、消瘦等為主[4-7]。目前青藏高原地區(qū)，公開(kāi)報(bào)道的會(huì)感染牦牛的梨形蟲(chóng)病病原主要有中華泰勒蟲(chóng)、呂氏泰勒蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)等[8-10]。在已報(bào)道的牦牛泰勒蟲(chóng)病原中，環(huán)形泰勒蟲(chóng)對(duì)家畜的危害最為嚴(yán)重，其次是東方泰勒蟲(chóng)、中華泰勒蟲(chóng)等，呂氏泰勒蟲(chóng)其致病性較強(qiáng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患畜死亡，被稱(chēng)為“惡性泰勒蟲(chóng)”[11-13]。道孚縣位于四川西北部，甘孜東北部，整體養(yǎng)殖方式粗放，相關(guān)人員防治意識(shí)淡薄，牦牛梨形蟲(chóng)感染情況嚴(yán)重，給農(nóng)牧民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。藍(lán)嵐等[9]于2018年6-11月，對(duì)甘孜18個(gè)縣(市)牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況進(jìn)行調(diào)查，采集牦牛全血1 381份，梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為31.72%，其中道孚縣為28.99%。目前未有對(duì)該縣牦牛梨形蟲(chóng)流形特點(diǎn)的確切報(bào)道，因此對(duì)道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)流行特點(diǎn)的調(diào)查及防治措施的研究很有必要，對(duì)梨形蟲(chóng)病的早期防控具有重要意義。貝尼爾是目前常用的抗梨形蟲(chóng)藥物[14-15]，療效確切，但副作用較大，且易產(chǎn)生耐藥性。中藥有營(yíng)養(yǎng)和藥物的雙重作用，且具有低殘留、低耐藥性的特點(diǎn)，是首選的綠色獸藥產(chǎn)品[16-18]。本試驗(yàn)研究了貝尼爾結(jié)合中藥方劑、青蒿、百部對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)病的防治效果，為牦牛梨形蟲(chóng)病的防治提供新的途經(jīng)和有效方法。

1 材料與方法

1.1 牦牛血樣采集

2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月，自道孚縣每月定點(diǎn)采集牦牛全血173份，標(biāo)記時(shí)間、年齡、體重，裝于一次性真空抗凝管置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。所有的血樣均放在-20℃冰箱保存。

1.2 蜱蟲(chóng)采集

于2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月采集牦牛血樣時(shí)，采集血樣的牦牛體表如有蜱，采集后裝入收集管，放入75%酒精溶液中，并置于4℃冰箱保存待檢。

1.3 試驗(yàn)藥物

貝尼爾(購(gòu)于四川恒通動(dòng)物制藥有限公司，批號(hào) 20180901)，中藥購(gòu)自中藥房。

1.4 牦牛梨形蟲(chóng)的分子檢測(cè)

1.4.1 全血總 DNA 提取

采用酚-氯仿法提取牦牛全血總 DNA。

1.4.2 18S rRNA 引物的設(shè)計(jì)

采用以18S RNA為靶基因的梨形蟲(chóng)巢式 PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。引物信息為外上游引物:GATAACCGTGCTAATTGTAGG，外下游引物:ATCGTCTTCGATCCCCTAACT，擴(kuò)增片段大小為 843 bp；內(nèi)上游引物:AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG，內(nèi)下游引物:GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC，擴(kuò)增片段大小為 760 bp，靶基因 18SrRNA。

1.4.3 蟲(chóng)種鑒定

隨機(jī)挑選部份牦牛梨形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性樣本共計(jì)38份的PCR產(chǎn)物送生工(上海)測(cè)序。通過(guò)NCBI上的BLAST對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)；采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1000)基于梨形蟲(chóng)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，運(yùn)用Lasergene 7.0軟件對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，根據(jù)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)及同源性分析結(jié)果鑒定梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種。

1.5 媒介蜱的形態(tài)學(xué)鑒定

采用體式顯微鏡對(duì)蜱初步進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.6 中藥防治研究

選擇有梨形蟲(chóng)感染，年齡、體型相似的牦牛35頭，隨機(jī)分為5組，每組4～10頭。藥物組1:貝尼爾結(jié)合中藥方劑，貝尼爾，3 mg/(kg體重)，臨用前配成5%～7%溶液，肌注；中藥方劑，秦艽散加減方:秦艽30 g、當(dāng)歸25 g、赤芍 25 g、瞿麥20 g、車(chē)前子20 g、焦梔子20 g、大黃20 g、茯苓 20 g、淡竹葉15 g、燈心草15 g、川楝子18 g、甘草20 g，500 mL/頭，灌服，1次/d，連續(xù)給藥3 d。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。藥物組2:百部，25～30 g/頭，粉為細(xì)末，拌料喂。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。藥物組3:青蒿藥液，60 g/頭，灌服。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。陽(yáng)性藥物組:貝尼爾，肌注，3～5 mg/kg，臨用前配成 5%～7% 溶液。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。空白組:進(jìn)行體外滅蜱。用藥前及用藥后50 d，稱(chēng)重并采集牦牛血液進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，對(duì)梨形蟲(chóng)病原進(jìn)行檢測(cè)，分析中藥防治效果。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)整體感染情況

采集血樣173份，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增其18S rRNA部分基因序列，其中有59份樣本擴(kuò)增出目的條帶，梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為34.10%。部分樣本PCR電泳結(jié)果，如圖1所示。

M—D2000 DNA Marker；2—陽(yáng)性對(duì)照；1—陰性對(duì)照(去離子水)；3～13—牦牛全血樣本

2.2 不同月份牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

定點(diǎn)對(duì)道孚縣進(jìn)行為期 6 個(gè)月的跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)各月份均有梨形蟲(chóng)感染，4月、5月、6月、7月、9月、10月平均陽(yáng)性率分別為:28.00%(25/7)、66.67%(15/10)、51.02%(49/25)、34.62%(26/9)、14.63%(41/6)、11.76%(17/2)。5月、6 月牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均顯著高其高于其他月份(P<0.05)，之后成下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖2，圖2中所標(biāo)字母相異(a～c)表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 牦牛感染梨形蟲(chóng)的季節(jié)動(dòng)態(tài)

2.3 不同年齡組牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

各個(gè)年齡段梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率也均不相同。犢牦牛組(0～2 歲)梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為 34.48%(29/10)，青年牦牛組(2～5 歲)為 45.78%(83/38)，成年牦牛組(5 歲以上)為 18.03%(61/11)。由圖3可知，青年組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率最高，顯著高于犢牦牛組和成年組(P<0.05)。成年組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率最低，顯著低于犢牦牛組和青年組(P<0.05)。表明青年組牦牛(2～5歲)最易感染牦牛梨形蟲(chóng)病。

圖3 不同年齡組牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

2.4 不同體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

對(duì)感染梨形蟲(chóng)牦牛的體重進(jìn)行分析。小于 100 kg、100～200 kg及大于 200 kg的牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為:42.11%(95/40)、28.57(63/18)、6.67%(15/1)。小于 100 kg、100～200 kg 的牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均顯著高于 200 kg 以上的牦牛(P<0.05)，感染梨形蟲(chóng)的牦牛體重明顯下降，如圖4所示。

圖4 不同體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

2.5 牦牛梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種檢測(cè)結(jié)果

從牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性樣本中挑選 38 份樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定蟲(chóng)種，鑒定蟲(chóng)種1個(gè)，均為中華泰勒蟲(chóng)?；诶嫘蜗x(chóng)18SrRNA基因序列建立進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行牦牛梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定。由圖5可見(jiàn)，中華泰勒蟲(chóng)大枝包括道孚檢測(cè)出的中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株 38 株及Genback 中已發(fā)表的甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)，其又分為兩小枝，其中一支為檢測(cè)出的中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株 33 株(Yak-32、6-7)與已發(fā)表的甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)，另一支為檢測(cè)出的其他中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株5株(5-2、6-13、6-4、5-1、5-3)。

將檢測(cè)到的蟲(chóng)株在 MegAlign 軟件上進(jìn)行同源性比對(duì)分析，測(cè)出的中華泰勒蟲(chóng)之間的同源性為 94.20%～100.00%，與已發(fā)表的蟲(chóng)株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之間的同源性為 94.50%～100.00%。

2.6 蜱蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

共采集到蜱蟲(chóng)199 只，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，均為微小扇頭蜱，如圖6所示。

Yak-32—中華泰勒蟲(chóng)32個(gè)樣本序列；▲—其他樣本序列；■—已發(fā)表的中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株

A—微小扇頭蜱背面；B—微小扇頭蜱腹面

2.7 中藥防治效果觀(guān)察

2.7.1 中藥防治對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)感染情況的影響

對(duì)用藥前后牦牛梨形蟲(chóng)感染情況進(jìn)行檢測(cè)。由表1可知，空白組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率為100%，各藥物組梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均呈下降趨勢(shì)；藥物組 1、2牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率與陽(yáng)性藥物組相比有所降低。

2.7.2 中藥防治對(duì)牦牛體重的影響

對(duì)上述有梨形蟲(chóng)感染的35頭牦牛進(jìn)行防治，由表2可知，各藥物組牦牛的體重均有增加，陽(yáng)性藥物組、藥物組1、2、3 牦牛AG、ADG均比空白組高。藥物組1、2牦牛AG、ADG顯著高于陽(yáng)性藥物組和空白組(P<0.05)。藥物組3牦牛AG高于陽(yáng)性藥物組和空白組，但差異不顯著；ADG顯著高于空白組(P<0.05)，較高于陽(yáng)性藥物組，差異不顯著。

表1 中藥防治對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)感染情況的影響

表2 中藥防治對(duì)牦牛體重的影響

2.7.3 中藥防治對(duì)牦牛 RBC、HGB 的影響

用藥前后對(duì)試驗(yàn)組35頭牦牛血液進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，用藥前10頭牦牛 RBC、HGB低于參考值。由表3可知，各用藥組牦牛RBC、HGB均有升高，陽(yáng)性藥物組和藥物組1、2、3牦牛RBC、HGB均達(dá)到參考值；空白組牦牛RBC未達(dá)到參考值，HGB達(dá)到參考值。

表3 中藥防治對(duì)牦牛RBC、HGB的影響

3 討論

近年來(lái)，陸續(xù)有關(guān)于青藏高原地區(qū)牦牛感染梨形蟲(chóng)的報(bào)道，但目前為止，對(duì)牦牛感染梨形蟲(chóng)規(guī)律的確切報(bào)道較少。本試驗(yàn)正是基于這一現(xiàn)狀，2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月定點(diǎn)對(duì)道孚縣牦牛進(jìn)行為期6個(gè)月的跟蹤調(diào)查，首次分析不同月份、年齡段及體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況，為道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)病的防治提供依據(jù)。

18S rRNA具有保守性和高變性，還可對(duì)感染蟲(chóng)種進(jìn)行鑒定，在梨形蟲(chóng)檢測(cè)中廣泛應(yīng)用且效果良好[19，21]。本實(shí)驗(yàn)采用以18S rRNA 為靶基因的梨形蟲(chóng)巢式PCR方法，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及同源性分析，對(duì)四川省道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)病原及蟲(chóng)種進(jìn)行檢測(cè)。

本次調(diào)查顯示道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率為34.10%，道孚縣平均海拔約3 245 m，為半農(nóng)半牧業(yè)縣，與純牧業(yè)縣相比，灌木叢較多，良好的自然環(huán)境及較高的生物多樣性，為蜱蟲(chóng)提供了適宜的環(huán)境條件，增加了蜱侵襲牦牛，傳播梨形蟲(chóng)病的概率。5-6月份為感染高峰期，梨形蟲(chóng)是一種由蜱傳播的血液原蟲(chóng)病[20]，所以其感染率與蜱蟲(chóng)的活動(dòng)規(guī)律密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將采集到的蜱蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，均為微小扇頭蜱。微小扇頭蜱在我國(guó)分布廣泛，主寄生于大家畜體表，如黃牛、牦牛、綿羊等[21]，主要生活在農(nóng)區(qū)，氣候溫和，雨量充沛的季節(jié)蜱蟲(chóng)活躍度開(kāi)始增高。呈季節(jié)消長(zhǎng)性，一二月寄生數(shù)量不多，3月開(kāi)始數(shù)量逐漸增多，直到6月達(dá)到最高峰，以后數(shù)量又逐漸減少，但終年都存在[22]。道孚縣春夏不分明，冬長(zhǎng)夏短，冬寒干燥，五六月份氣溫開(kāi)始升高，降水量、植被增多，蜱蟲(chóng)開(kāi)始活躍。本實(shí)驗(yàn)牦牛感染梨形蟲(chóng)的季節(jié)動(dòng)態(tài)與微小扇頭蜱活動(dòng)季節(jié)趨于一致。本實(shí)驗(yàn)梨形蟲(chóng)青年組牦牛(2～5歲) 最易感染中華泰勒蟲(chóng)病，與劉道鑫等[23]不同年齡階段牦牛泰勒蟲(chóng)病的調(diào)查結(jié)果:2～3歲牦牛最易感染泰勒蟲(chóng)病，趨于一致，應(yīng)注意該年齡段牦牛梨形蟲(chóng)病的防控。本次檢測(cè)顯示優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為中華泰勒蟲(chóng)，與藍(lán)嵐等[9]對(duì)四川甘孜進(jìn)行的牦牛梨形蟲(chóng)感染情況調(diào)查結(jié)果:優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為中華泰勒蟲(chóng)與呂氏泰勒蟲(chóng)；以及鐘維等[10]對(duì)四川省阿壩州5個(gè)縣進(jìn)行的牦牛梨形蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果:感染蟲(chóng)種均為中華泰勒蟲(chóng)，趨于一致。本次檢測(cè)牦牛均未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀，說(shuō)明中華泰勒蟲(chóng)為溫和型泰勒蟲(chóng)[24]，裂殖體并不起主要作用。但是比較不同體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況，結(jié)果顯示，感染梨形蟲(chóng)的牦牛體重明顯下降，除此之外對(duì)有梨形蟲(chóng)感染的 35 頭牦牛進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，10 頭存在貧血現(xiàn)象。梨形病感染會(huì)導(dǎo)致牦牛生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、產(chǎn)肉量下降等[25-26]，大大降低了農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)收入，所以做好梨形蟲(chóng)病的防治工作對(duì)農(nóng)牧民增收有重要的意義。

目前防治梨形蟲(chóng)病多采用貝尼爾、鹽酸吖啶磺等，但其副作用大，病牛體質(zhì)恢復(fù)較慢且均需肌肉或靜脈注射，一般需要專(zhuān)業(yè)獸醫(yī)人員進(jìn)行操作，目前甘孜牧區(qū)保定設(shè)施及基層獸醫(yī)人員缺乏，臨床普及不易。中藥副作用小，功效獨(dú)特，諸多藥物具有增強(qiáng)免疫力、抗菌驅(qū)蟲(chóng)、保健防病的作用[27-28]，對(duì)牦牛感染梨形蟲(chóng)后的體質(zhì)有改善作用。且中藥價(jià)格便宜，多采用拌料或灌服，農(nóng)牧民自己即可操作，較易普及。栗明來(lái)等[29]用三氮瞇結(jié)合中藥方劑同時(shí)應(yīng)用，取得確實(shí)的療效。王守文等[30]對(duì)中西藥治療羊梨形蟲(chóng)病效果進(jìn)行對(duì)比，三氮脒治愈率為 73.5%，采用中西藥物結(jié)合治療，療效確實(shí)顯著，治愈率達(dá)97.6%。國(guó)內(nèi)報(bào)道運(yùn)用中西藥結(jié)合治療梨形蟲(chóng)病的越來(lái)越多。秦艽散具有祛瘀止血，清熱利尿的功能，主治膀胱積熱，努傷尿血[31]，本實(shí)驗(yàn)減去秦艽散中黃芩、紅花、蒲黃、大黃、白芍、天花粉，加上赤芍、連翹、茯苓、燈心草、川楝子等清熱涼血、清熱解毒、利水利尿、驅(qū)蟲(chóng)藥物，組成具有清熱利尿、祛瘀止血、補(bǔ)血和中、補(bǔ)氣、驅(qū)蟲(chóng)、健脾生血、增強(qiáng)體質(zhì)功效的中藥方劑。將該方劑結(jié)合貝尼爾對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)進(jìn)行防治，用藥后牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率下降，牦牛 AG、ADG 顯著高于陽(yáng)性藥物組和空白組，且改善了牦牛的貧血現(xiàn)象，說(shuō)明中西藥結(jié)合防治牦牛梨形蟲(chóng)病可大大提高防治效果。百部具有殺蟲(chóng)的功效[31]，青蒿具有殺原蟲(chóng)、清熱解毒的功效[31]。鄭海等[32]研究了中藥百部對(duì)羊泰勒焦蟲(chóng)病的防治效，發(fā)現(xiàn)其治療效果優(yōu)于貝尼爾，而預(yù)防效果相同。丁景昌等[33]采用用青篙對(duì)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，其可直接殺滅雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)，屬于高效抗雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)的藥物。本實(shí)驗(yàn)分別采用百部及青蒿對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)病進(jìn)行防治，各藥物組梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均呈下降趨勢(shì)。百部組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率與陽(yáng)性藥物組相比有所降低，牦牛 AG、ADG 顯著高于陽(yáng)性藥物組和空白組(P<0.05)。青蒿組牦牛 AG 高于陽(yáng)性藥物組和空白組，但差異不顯著；ADG 顯著高于空白組(P<0.05)，較高于陽(yáng)性藥物組，差異不顯著。兩組牦牛貧血現(xiàn)象均有改善。說(shuō)明百部與青蒿均有防治牦牛梨形蟲(chóng)病的效果，百部可作為高效防治牦牛梨形蟲(chóng)病的藥物。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)首次對(duì)道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)不同月份、年齡段及體重的感染情況進(jìn)行調(diào)查，道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)感染率較高，不同月份、年齡段、體重間存在差異，優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為中華泰勒蟲(chóng)，主要傳播媒介為微小扇頭蜱。中西藥結(jié)合防治牦牛梨形蟲(chóng)病效果顯著，百部與青蒿均有防治牦牛梨形蟲(chóng)病的效果。百部及青蒿防治梨形蟲(chóng)病，使用方便，農(nóng)牧民自己即可操作，可減輕大群投藥時(shí)的勞動(dòng)強(qiáng)度，易推廣。由于試驗(yàn)樣本數(shù)太少，因此對(duì)于百部及青篙防治梨形蟲(chóng)病的有效成分及其藥理作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。