張 雪金美玉于 洋鄭志紅*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,沈陽 110000； 2.遼寧省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110000)

卵泡發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而又精密的調(diào)控過程[1],從原始生殖細(xì)胞分化為卵原細(xì)胞,再到原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡,經(jīng)歷了一系列特定基因的程序性表達(dá)[2]。Nobox是小鼠生殖細(xì)胞特異性表達(dá)基因,編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,主要表達(dá)于卵巢組織,其基因敲除小鼠顯示卵巢早衰[3-5],雌鼠無生育能力[6-7]。Nobox在整個(gè)卵泡發(fā)育階段均有表達(dá),參與原始卵泡的形成及激活。 由于卵泡發(fā)育是連續(xù)動(dòng)態(tài)的過程,生殖細(xì)胞特異性基因具有階段性特征,有必要分階段對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的作用進(jìn)行研究。 目前廣泛性敲除Nobox只能探究其在原始卵泡中的作用機(jī)制,其在初級(jí)卵泡及之后的作用尚未有人研究。Kit作為廣泛性表達(dá)基因,在生殖細(xì)胞中也發(fā)揮著重要的作用。Kit表達(dá)于卵泡發(fā)育的所有階段,貫穿整個(gè)卵子發(fā)生過程,影響PGCs 的增殖和分化,可參與PI3K/AKT 和KITL/KIT 通路影響卵泡發(fā)育[8-9]。 在原始卵泡激活過程中,生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1 可直接轉(zhuǎn)錄激活Kit表達(dá),并通過PI3K/AKT 通路參與原始卵泡激活[8,10-11]。 與NOBOX 表達(dá)模式不同,SOHLH1 只表達(dá)于卵原細(xì)胞、原始卵泡,在初級(jí)卵泡中表達(dá)逐漸消失,而在次級(jí)卵泡和其之后的階段不再表達(dá)[12-13]。 當(dāng)原始卵泡發(fā)育為初級(jí)卵泡后,SOHLH1 表達(dá)逐漸消失,Kit仍持續(xù)大量表達(dá),此時(shí)Kit還應(yīng)受到其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。 作為生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,NOBOX 在卵泡整個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),通過軟件分析發(fā)現(xiàn)Kit啟動(dòng)子存在多個(gè)NOBOX 結(jié)合位點(diǎn)(NBE),存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性。 此外,在初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡過程中,TGF-β/SMADs 信號(hào)通路作為卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞溝通的標(biāo)志性通路開始調(diào)控卵泡發(fā)育[14-17]。 生長因子GDF9 作為TGF-β 超級(jí)家族的成員,在初級(jí)卵泡中開始表達(dá),已有研究表明NOBOX 可直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控Gdf9[18],并參與GDF9/SMAD 通路影響顆粒細(xì)胞增殖分化。 本研究擬探索在初級(jí)卵泡發(fā)育階段,轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 對(duì)Kit的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,以及通過GDF9/SMAD 通路對(duì)卵泡發(fā)育的影響,完善轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 在卵泡發(fā)育過程中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中共使用20 只20 d 日齡及9 只6 周齡的SPF 級(jí)C57BL/6J 雌性小鼠(三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)),體重分別約9～12 g 及16～18 g(誤差不大于10%),來源于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[SCXK(遼) 2018-0004],取材在中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(遼)2018-0008],取材過程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 審查通過(2019260)。

1.2 主要試劑與儀器

M2 培養(yǎng)基(Cat#M7167,Sigma)；α-MEM(Cat#32571036,Gibco)；FBS(Cat#FB15011,CLARK)；ITS(Cat#I3146,Sigma)；谷氨酸鹽(Cat#25030-801,Gibco)；礦物油(Cat#M8410,Sigma)；Nobox-siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司, 中國)；LipofectamineTM3000 (Cat # L3000015, Invitrogen)；MinuteTM蛋白提取試劑盒(Cat#SD001/SN-002,Invent)；Anti-NOBOX(Cat#sc-514178,Santa)；Anti-KIT(Cat #3074 s, Cell Signal Technology)； Anti-Phospho-SMAD2/SMAD3(Cat#8828 s,Cell Signal Technology )； Anti-GAPDH ( Cat # YM3029,Immunoway)；mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(Cat#AM1561, Invitrogen )； EZ-ChIPTM- Chromatin Immunoprecipitation Kit(Cat#17-371,Millipore)；體式顯微鏡(麥克奧迪電器股份有限公司,中國)；顯微操 縱 器( Eppendorf, 德 國)； 微 量 注 射 儀(Eppendorf,德國)；拉針儀(Sutter,美國)；顯微鏡熱臺(tái)(東海,日本)；Western blot 電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 初級(jí)卵泡分離、體外培養(yǎng)及顯微注射

培養(yǎng)基準(zhǔn)備:(1)體外分離M2 培養(yǎng)基(2)卵泡培養(yǎng)基:α-MEM+20%FBS+1×ITS+1×谷氨酸鹽+1%青鏈霉素,分別將兩種培養(yǎng)基于6 cm 培養(yǎng)皿中滴好若干5 μL 微滴,覆蓋礦物油,提前2 h 置于培養(yǎng)箱平衡。

無菌條件下取5 只20 d 日齡C57BL/6J 雌鼠卵巢置于4℃預(yù)冷的PBS 中,剝?nèi)ブ車炯敖Y(jié)締組織后,轉(zhuǎn)移至M2 液滴中,刺破卵巢釋放卵泡并通過自制卵泡口吸管收集初級(jí)卵泡。 通過卵泡直徑及形態(tài)區(qū)分各級(jí)卵泡:原始卵泡直徑小于40 μm,卵母細(xì)胞周圍由單層扁平顆粒細(xì)胞包裹；初級(jí)卵泡直徑約40～100 μm,卵母細(xì)胞由單層立方狀顆粒細(xì)胞包裹；次級(jí)卵泡直徑約100～200 μm,由兩層以上顆粒細(xì)胞包裹。 第一組吸取100 個(gè)初級(jí)卵泡直接轉(zhuǎn)移至卵泡培養(yǎng)基液滴中作為空白對(duì)照,即不加任何處理因素(每個(gè)液滴中培養(yǎng)1 個(gè)初級(jí)卵泡)；第二組吸取100 個(gè)初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)移至M2 液滴中,注射10 pL 緩沖液(DEPC 水)至卵母細(xì)胞后,再將卵泡轉(zhuǎn)移至卵泡培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照；第三組吸取100 個(gè)初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)移至M2 液滴中,注射10 pLNobox-siRNA 至卵母細(xì)胞后,再將卵泡轉(zhuǎn)移至卵泡培養(yǎng)基作為注射siRNA 組,三組卵泡均置于37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)數(shù)日,隔天換液,每24 h 觀察并記錄三組初級(jí)卵泡發(fā)育情況及發(fā)育至次級(jí)卵泡時(shí)間。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)注射Nobox-siRNA 后相關(guān)基因mRNA 表達(dá)變化

37℃,5% CO2條件下分別培養(yǎng)①空白對(duì)照組(未注射組,不加任何處理因素)②陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)③實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)三組初級(jí)卵泡,每組200 個(gè)初級(jí)卵泡,24 h 后收集,采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit 試劑盒分別提取三組的初級(jí)卵泡RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,qRT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)變化,引物序列如下:NoboxF:5’-GGCACTAGTATCGCCTCACC-3’,NoboxR: 5 ’-CATTGAGCTTGGGATGGGGT-3 ’；KitF: 5 ’-GATGGTGGGAATGGGTCAGA-3 ’,KitR: 5 ’-TCCATGTCGTCCCAGTTGGT-3 ’；Gdf9 F: 5 ’-GTCACCTCTACAATACCGTCCG-3’,Gdf9 R: 5’-CACCCGGTCCAGGTTAAACA-3 ’；KitlF: 5 ’-TCTGCGGGAATCCTGTGACT-3 ’,KitlR: 5 ’-CGGCGACATAGTTGAGGGTTAT-3’；β-actinF:5’-GATGGTGGGAATGGGTCAGA-3’,β-actinR: 5’-TCCATGTCGTCCCAGTTGGT-3’。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)注射Nobox-siRNA 后相關(guān)基因蛋白表達(dá)變化

37℃,5% CO2條件下分別培養(yǎng)①陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)②實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)的兩組初級(jí)卵泡,每組100 個(gè)初級(jí)卵泡,24 h 后收集,采用MinuteTM蛋白提取試劑盒分別提取各組初級(jí)卵泡蛋白(檢測(cè)Phospho-SMAD2/3 提取核蛋白),100℃煮沸5 min 變性。 SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉。Anti-NOBOX 抗體以1 ∶100 比例稀釋；Anti-KIT 抗體以1 ∶1000 比例稀釋；Anti-Phospho-SMAD2/3 抗體以1 ∶1000 比例稀釋；Anti-GAPDH 抗體以1 ∶5000 比例稀釋,4℃搖床孵育過夜。 次日去除一抗孵育二抗(1 ∶5000)滴加ECL 發(fā)光液使用化學(xué)發(fā)光分析儀采集信息,并拍照記錄。

1.3.4 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)驗(yàn)證NOBOX 與Kit基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況

取6 對(duì)6 周齡C57BL/6J 小鼠卵巢,按照EZChIPTM- Chromatin Immunoprecipitation Kit 試劑盒說明書提取NOBOX 抗體結(jié)合的DNA 片段。 針對(duì)Kit轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-6177 bp ～-5218 bp、-4092 bp ～-2228 bp 序列(此區(qū)域?yàn)镵it啟動(dòng)子有效啟動(dòng)區(qū)域[19])使用JASPAR 軟件預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 特異性結(jié)合位點(diǎn)NBE,在Kit基因啟動(dòng)子中查找轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 評(píng)分較高的5 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)NBE(圖1),并設(shè)計(jì)ChIP-PCR 引物驗(yàn)證。ChIP 引 物 序 列 如 下: Chip-Kit-960-1F: 5 ’-ATGAGGTGCCCTTGTGAG-3’,Chip-Kit-960-1R:5’-TCCAGACCGGAAGTGTTC-3’；Chip-Kit-960-2F:5’-CTCCGTTGAGCAGGGTTA-3’,Chip-Kit-960-2R:5’-CCTGGGAAGGAAAAGTCC-3 ’； Chip-Kit-1865-1F:5’-GGTTCATTCCCATAGCCC-3’,Chip-Kit-1865-1R:5’-ACCCACCTCACATCTCCTTA-3’； Chip-Kit-1865-2F:5’-TGTCTCAGGAGTGGGTTG-3’,Chip-Kit-1865-2R: 5’-CGTTCTGATAAGAGGCAAT-3’； Chip-Kit-1865-3F:5’-TGCCTCTTATCAGAACGG-3’,Chip-Kit-1865-3R: 5’-CCCAGGACTTGCCAGTAG-3’。 PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 結(jié)合區(qū)域,驗(yàn)證在Kit基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

三組初級(jí)卵泡培養(yǎng)過程中發(fā)育為次級(jí)卵泡所占比例及卵泡存活率通過ANOVA 檢驗(yàn)組間差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

檢測(cè)目的基因mRNA 表達(dá)變化時(shí),每個(gè)目的基因重復(fù)3 次qRT-PCR 實(shí)驗(yàn),內(nèi)參基因?yàn)棣?actin,△Ct 值為目的基因Ct 值-內(nèi)參基因Ct 值,△△Ct值為注射Nobox-siRNA 組目的基因的△Ct 值-陰性對(duì)照組目的基因的△Ct 值。 將陰性對(duì)照組的基因表達(dá)量設(shè)為1,計(jì)算注射Nobox-siRNA 組目的基因表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組目的基因表達(dá)量的比值(2-△△Ct),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPad 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±)表示,采用t檢驗(yàn),以P＜0.05 為差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Kit 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游評(píng)分較高NBEFigure 1 NBE with higher score upstream of Kit transcription initiation site

注:A:圖中均為體外成功分離的單個(gè)初級(jí)卵泡,如箭頭所示。圖2 預(yù)實(shí)驗(yàn)分離出單個(gè)初級(jí)卵泡及卵泡發(fā)育時(shí)間統(tǒng)計(jì)Note. A, These are all single primary follicles successfully isolated in vitro, as shown by the arrows.Figure 2 Statistics of single primary follicle and follicle development time isolated in the preliminary experiment

2 結(jié)果

2.1 初級(jí)卵泡體外培養(yǎng)及顯微注射

由于無法保證分離的單個(gè)初級(jí)卵泡處于統(tǒng)一發(fā)育狀態(tài),因此已通過預(yù)實(shí)驗(yàn)分離出480 個(gè)初級(jí)卵泡(圖2A),轉(zhuǎn)移至96 孔板每孔單獨(dú)培養(yǎng),觀察并記錄480 個(gè)初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡所需時(shí)間及所占比例。 結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡的最短時(shí)間為2 d,最長為7 d,第5 天時(shí),初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)的比例最高(圖2B),因此體外培養(yǎng)初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡的時(shí)間為5 d。

37℃,5% CO2條件下分別培養(yǎng)①空白對(duì)照組(未注射組,不加任何處理因素)②陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)③實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)三組初級(jí)卵泡,每24 h 拍照記錄卵泡發(fā)育情況并進(jìn)行比較。 三組初級(jí)卵泡培養(yǎng)過程中的存活及死亡情況見圖3,比較三組卵泡存活率,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),結(jié)果表明體外分離及顯微注射等操作未對(duì)初級(jí)卵泡存活造成影響。

圖3 三組初級(jí)卵泡體外培養(yǎng)不同天數(shù)存活率(n=100)Figure 3 The survival rate of three groups of primary follicles was different in vitro

注:B:顯微鏡下觀察三組初級(jí)卵泡體外培養(yǎng)7 d 的發(fā)育情況。圖4 體外培養(yǎng)三組初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡的發(fā)育時(shí)間及存活率Note. B, The development of primary follicles in three groups cultured for 7 d in vitro was observed under microscope.Figure 4 Development time and survival rate of primary follicles to secondary follicles in three groups cultured in vitro

觀察并記錄三組初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡所需時(shí)間及所占比例,結(jié)果顯示,空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組均第2 天開始逐漸發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,第5 天發(fā)育至次級(jí)卵泡(卵泡直徑大于100 μm)(圖4A、4B)；注射Nobox-siRNA 組與陰性對(duì)照組相比:陰性對(duì)照組的初級(jí)卵泡從第2 天開始逐漸發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,第5 天可發(fā)育至次級(jí)；而注射Nobox-siRNA 組的初級(jí)卵泡1～4 d 無明顯形態(tài)學(xué)變化,卵泡直徑無明顯增長,第5 天開始逐漸發(fā)育,顆粒細(xì)胞增厚,卵泡體積增大,第7 天可發(fā)育為次級(jí)卵泡。 結(jié)果表明,Nobox-siRNA 干擾初級(jí)卵泡后,卵泡暫時(shí)停止發(fā)育,顆粒細(xì)胞增殖停滯,初級(jí)卵泡延緩2 d 發(fā)育至次級(jí)(圖4A、4B)。

注:A:誤差線代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差；1:陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)；2:空白對(duì)照組(未注射組)；3:實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)。 與陰性對(duì)照組比較,ns:P ＞0.05,***P＜0.001。 B:1:陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)；2:實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)。圖5 Nobox-siRNA 干擾后初級(jí)卵泡中Nobox mRNA 及蛋白表達(dá)情況Note. A, Error bars represent the mean ± standard error of three replicate experiments. 1, Negative control group ( injected DEPC water)； 2, No-treatment control group (no injection group)； 3, Experimental group (Nobox-siRNA injection).Compared with the negative control group, ns, P＞0.05,***P＜0.001. B, 1, Negative control group (injected DEPC water)；2, Experimental group (injection of Nobox-siRNA).Figure 5 Expression of Nobox mRNA and protein in primary follicles after Nobox-siRNA interference

2.2 初級(jí)卵泡中注射Nobox-siRNA 后Nobox mRNA 及蛋白表達(dá)情況

37℃,5% CO2條件下分別培養(yǎng)①空白對(duì)照組(未注射組,No-treatment Control)②陰性對(duì)照組(注射DEPC 水, Negative Control) ③實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)的三組初級(jí)卵泡,每組300 個(gè),24 h 后提取其中200 個(gè)初級(jí)卵泡RNA,反轉(zhuǎn)為cDNA,經(jīng)qRT-PCR 發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比數(shù)據(jù)無顯著性差異,P＞0.05,顯微注射操作不影響初級(jí)卵泡中Nobox表達(dá)；注射Nobox-siRNA 組與陰性對(duì)照組相比,NoboxmRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào),差異極顯著,P＜0.001(圖5A)。 分別提取陰性對(duì)照組與注射Nobox-siRNA 組的100 個(gè)初級(jí)卵泡蛋白,經(jīng)Western blot 發(fā)現(xiàn),注射Nobox-siRNA 組與陰性對(duì)照組相比,NOBOX 蛋白表達(dá)明顯減少(圖5B)。 結(jié)果表明,在初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞中顯微注射NoboxsiRNA 可有效導(dǎo)致初級(jí)卵泡中Nobox基因沉默。

2.3 初級(jí)卵泡中Nobox 干擾后相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)變化

37℃,5% CO2條件下分別培養(yǎng)①空白對(duì)照組(未注射組,No-treatment Control)②陰性對(duì)照組(注射DEPC 水, Negative Control) ③實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)的三組初級(jí)卵泡,cDNA 模板與結(jié)果2.2 為同一批反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；24 h 后提取陰性對(duì)照組與注射Nobox-siRNA 組的100 個(gè)初級(jí)卵泡蛋白。 通過qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比數(shù)據(jù)無顯著性差異,P＞0.05,顯微注射操作不影響初級(jí)卵泡中Kit、Kitl、Gdf9 mRNA 表達(dá)；注射Nobox-siRNA 組與陰性對(duì)照組相比,初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞中的Kit、Kitl、Gdf9 基因mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào),P＜0.001(圖6A-6C),經(jīng)Western blot 發(fā)現(xiàn),注射Nobox-siRNA 后初級(jí)卵泡中KIT、P-SMAD2 /SMAD3 蛋白表達(dá)量明顯降低(圖6D)。 結(jié)果表明,NOBOX 在初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡階段可能經(jīng)KITL/KIT 及GDF9/SMAD 通路影響卵泡發(fā)育。

2.4 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)驗(yàn)證NOBOX 與Kit啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域

ChIP 實(shí)驗(yàn)中與NOBOX 抗體結(jié)合的DNA 片段洗脫純化后進(jìn)行PCR 檢測(cè)。 將產(chǎn)物于2%瓊酯糖凝膠電泳,結(jié)果顯示為單一目的條帶,未見其他雜帶,轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 在Kit啟動(dòng)子(-2933 bp ～-2926 bp)、(-2874 bp ～-2867 bp)和(-2676 bp ～-2669 bp)位點(diǎn)能夠結(jié)合(圖7A,a-c),在Kit啟動(dòng)子(-5638 bp～-5634 bp)及(-5432 bp ～-5425 bp)位點(diǎn)無法結(jié)合(圖7A,d-e),表明轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 在雌性小鼠卵巢中可直接結(jié)合Kit基因啟動(dòng)子。

3 討論

卵巢中SOHLH1、SOHLH2、NOBOX 等多種生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,在卵泡發(fā)育不同階段發(fā)揮著不同的作用。 SOHLH1/2、NOBOX 均參與原始卵泡形成及激活過程,不同的是,轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1/2只在卵原細(xì)胞和原始卵泡中表達(dá),初級(jí)卵泡表達(dá)較少,次級(jí)卵泡及之后無表達(dá),而NOBOX 的表達(dá)貫穿整個(gè)卵泡發(fā)育階段。 當(dāng)原始卵泡激活為初級(jí)卵泡后,SOHLH1/2 的表達(dá)逐漸消失,對(duì)于SOHLH1/2 直接調(diào)控的Kit等基因來說,還應(yīng)受到其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,有必要分階段對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的作用進(jìn)行研究。 本研究選擇卵泡發(fā)育過程中初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡的階段,在小鼠初級(jí)卵泡中顯微注射Nobox-siRNA,通過體外培養(yǎng)初級(jí)卵泡,觀察到注射Nobox-siRNA 的初級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞增殖停滯,延遲2 d 發(fā)育至次級(jí),說明Nobox是初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡的關(guān)鍵基因；通過檢測(cè)Kit、Gdf9、Kitl、P-SMAD的表達(dá)變化,說明初級(jí)卵泡中Nobox基因沉默對(duì)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間的KITL/KIT 及TGF-β/SMAD通路有抑制作用；通過ChIP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 可直接結(jié)合于Kit基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(-2933 bp ～-2926 bp)、(-2874 bp ～-2867 bp)和(-2676 bp ～-2669 bp)的NBE 位點(diǎn),推測(cè)NOBOX可直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控Kit基因的表達(dá)。

注:A-C:誤差線代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差；1:陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)；2:空白對(duì)照組(未注射組)；3:實(shí)驗(yàn)組(注射NoboxsiRNA)。 與陰性對(duì)照組比較,ns:P＞0.05,*P＜0.05,***P＜0.001。 D:M:蛋白Marker；1:實(shí)驗(yàn)組(注射Nobox-siRNA)；2:陰性對(duì)照組(注射DEPC 水)。圖6 Nobox-siRNA 干擾后初級(jí)卵泡中相關(guān)基因mRNA 及蛋白表達(dá)情況Note. A-C, Error bars represent the mean ± standard error of three replicate experiments. Compared with the no-treatment control group, 1, Negative control group (injected DEPC water)； 2, No-treatment control group (no injection group)； 3, Experimental group (Nobox-siRNA injection).Compared with the negative control group, ns:P＞0.05,*P＜0.05,***P＜0.001. D, M, Protein Marker； 1, Experimental group (injection of Nobox-siRNA)； 2, Negative control group (injected DEPC water).Figure 6 mRNA and protein expressions of related genes in primary follicles after Nobox-siRNA interference

注:A 圖中,a-c 代表NOBOX 可與Kit 啟動(dòng)子(-2933 bp ～-2926 bp)、(-2874 bp ～-2867 bp)和(-2676 bp ～-2669 bp)位點(diǎn)結(jié)合；d-e 表示NOBOX 在Kit 啟動(dòng)子(-5638 bp～-5634 bp)和(-5432 bp ～-5425 bp)位點(diǎn)無結(jié)合作用；M:TaKaRa DL2000 Marker；1:NOBOX-Kit；2:Input；3:陰性對(duì)照。 B:轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 與Kit 啟動(dòng)子-6177 bp～-5218 bp 區(qū)域和-4092 bp～-2228 bp 區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)示意圖。圖7 轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 與Kit 啟動(dòng)子結(jié)合情況Note. In Figure A, a～c means that NOBOX can bind to Kit promoter (-2933 bp～-2926 bp), (-2874 bp ～-2867 bp) and (-2676 bp～-2669 bp) sites； d～e shows that NOBOX has no binding effect at the Kit promoter sites (-5638 bp ～-5634 bp) and (-5432 bp ～-5425 bp)； M:TAKARA DL2000 Marker； 1: NOBOX-Kit； 2: Input； 3: Negative control. B: Schematic diagram of binding sites between transcription factor NOBOX and Kit promoter -6177 bp～-5218 bp region and -4092 bp ～-2228 bp region.Figure 7 Binding of transcription factor NOBOX to Kit promoter

表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞中的KITL,包含可溶性蛋白KITL1 和膜結(jié)合蛋白KITL2 兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,兩者雖功能相近,但是稍有不同,KITL1 主要促進(jìn)早期卵泡發(fā)育,而KITL2 對(duì)卵泡生長發(fā)育起調(diào)控作用[20]。除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的KITL/KIT 和GDF9/SMAD 通路外,本研究檢測(cè)到注射Nobox-siRNA 的初級(jí)卵泡中Kitl2顯著下調(diào),提示轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 在初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡階段,也可能通過TGF-β/SMAD/KITL通路且主要通過KITL2 影響卵泡發(fā)育,其具體機(jī)制尚待深入開展。

綜上所述,本研究證明NOBOX 是小鼠初級(jí)卵泡發(fā)育至次級(jí)卵泡的關(guān)鍵基因,首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 在小鼠卵巢中可直接結(jié)合Kit基因啟動(dòng)子,且影響初級(jí)卵泡中KITL/KIT 和GDF9/SMAD 通路,完善轉(zhuǎn)錄因子NOBOX 在卵泡發(fā)育過程中的作用機(jī)制。