朱建義,楊潔淼,趙浩宇,劉勝男,黃靜,周小剛*
(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,四川 成都 610066;2.農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點試驗室,四川 成都 610066;3.金堂縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,四川 金堂 610400)
隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展,食用菌栽培原料面臨資源短缺、價格高漲等問題,尋找新型培養(yǎng)基質(zhì)迫在眉睫[1]。平菇是我國栽培量和消費量最大的食用菌之一,隨著平菇生產(chǎn)規(guī)模逐年擴(kuò)大,培養(yǎng)基質(zhì)日趨緊張,新型培養(yǎng)基質(zhì)的研究相繼開展,范圍涵蓋果實、中藥材、木材、菌糠或菌渣、外來植物等[2]。陳若霞等[3]利用加拿大一枝黃花,周浩等[4]以大米草作為主料栽培平菇,陳謙等[5]研究了紫莖澤蘭對平菇產(chǎn)量及營養(yǎng)成分的影響。紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng)是一種入侵性惡性雜草,其營養(yǎng)豐富,是生產(chǎn)食用菌的優(yōu)質(zhì)原料[6-7]。利用其栽培食用菌,一方面為食用菌生產(chǎn)提供成本低廉、原料豐富的培養(yǎng)料,同時又可有效控制雜草危害,具有較好的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會效益。紫莖澤蘭是一種含有有毒物質(zhì)的有害雜草[8],利用其栽培平菇是否存在毒性殘留和富集的安全性問題,目前鮮有報道。明確利用紫莖澤蘭栽培平菇的安全性,可為新型基質(zhì)紫莖澤蘭的系統(tǒng)研究提供參考和依據(jù)。本研究使用紫莖澤蘭栽培平菇,并進(jìn)行毒理學(xué)研究,以明確其是否具有安全隱患。
1.1.1 樣品及菌種
紫莖澤蘭采自四川省西昌市;平菇雜優(yōu)1號,由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所提供;昆明種小白鼠,體重18~22 g,由山東大學(xué)試驗動物中心提供[試驗動物許可證號:SCXK(魯)20130009號]。
1.1.2 培養(yǎng)基
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g, 水1 000 mL。
常規(guī)平菇培養(yǎng)基:玉米芯70%,稻草10%,米糠10%,玉米粉7%,尿素0.5%,磷粉1%,石膏1.5%。
紫莖澤蘭平菇培養(yǎng)基:紫莖澤蘭42%,玉米芯28%,稻草10%,米糠10%,玉米粉7%,尿素0.5%,磷粉1%,石膏1.5%。
1.2.1 紫莖澤蘭前處理及栽培基質(zhì)配制
取曬干的紫莖澤蘭莖稈,粉碎成長度約5 mm的秸稈粉。先將紫莖澤蘭秸稈粉、玉米芯用1∶500倍克霉靈溶液3~4 h濕透后,撈出與其他原料按比例混合均勻,再加水拌勻,料水質(zhì)量比為1∶1.2~1.4,石灰先溶于水后取上清液加入,使pH達(dá)7.5~8.5?;靹?,建堆,蓋膜,待料溫升至55 ℃時進(jìn)行翻堆,一般情況翻堆1~2次即可,堆漚時間以15 d為宜。
1.2.2 出菇試驗
按上述方法將栽培基質(zhì)配制好后,裝袋,套上頸圈,包扎袋口,100 ℃滅菌36 h,冷卻后在無菌條件下接種平菇菌種。然后將菌袋置于培養(yǎng)室內(nèi),溫度25~27 ℃,相對濕度85%。待菌絲長滿菌袋,增加通風(fēng),控制溫度18~20 ℃,打開袋口待子實體生長成熟時采集子實體。
1.2.3 毒理學(xué)試驗
毒理學(xué)研究委托山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院進(jìn)行。分別采集紫莖澤蘭平菇(以下簡稱澤蘭平菇)和普通平菇子實體,曬干或烘干后各取干品2 kg,進(jìn)行小鼠經(jīng)口急性毒性試驗、小鼠30 d喂養(yǎng)試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核計數(shù)和小鼠精子畸形試驗。
將澤蘭平菇加工成粉末狀,配成所需濃度。按照GB 15193.3—2003,采用最大限量法進(jìn)行急性毒性試驗方法。選健康小鼠20只,其中雌雄各10只。動物禁食12 h后稱重分2次灌胃,灌胃體積按0.2 mL·kg-1體重計算,間隔6 h,劑量為15 000 mg·kg-1。動物給予受試物后連續(xù)觀察14 d,記錄動物中毒癥狀及死亡情況,最后根據(jù)動物死亡數(shù)量求出半數(shù)致死量(LD50)。
選健康小鼠50只,雌雄各半,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為5組,每組10只:大劑量組(10 g·kg-1組)、中劑量組(5 g·kg-1組)、小劑量組(2.5 g·kg-1組)、普通平菇組(10 g·kg-1)及對照組。試驗前將平菇粉摻入飼料中,加工成10%、5%、2.5%澤蘭平菇小鼠飼料及10%普通平菇小鼠飼料,大劑量組給予10%澤蘭平菇小鼠飼料,中劑量組給予5%澤蘭平菇小鼠飼料,小劑量組給予2.5%澤蘭平菇小鼠飼料,普通平菇組給予10%普通平菇小鼠飼料,對照組給予正常小鼠飼料,試驗動物連續(xù)喂養(yǎng)30 d。動物喂養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi)進(jìn)行。
試驗期間每天觀察記錄小鼠的活動、進(jìn)食情況及中毒癥狀,每周稱量小鼠體重。試驗結(jié)束時各組小鼠均采用摘眼球取血測定血液中白細(xì)胞總數(shù)(WBC)及分類(NEU、LYM)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板計數(shù)(PLT)、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量。并對全部動物進(jìn)行解剖,檢查腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腎上腺、睪丸、子宮等臟器情況,記錄所見異常變化。取腦、心、肝、脾、肺、腎、睪丸、腎上腺等主要臟器稱重,計算臟器系數(shù)(臟器重/體重×100%)。每組留取6只小鼠的主要臟器標(biāo)本,用10%甲醛固定后,進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查。
選健康小鼠50只,雌雄各半,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為5組,每組10只:澤蘭平菇大劑量組、中劑量組、小劑量組及陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予純凈水,陽性對照組給予40 mg·kg-1環(huán)磷酰胺腹腔注射。試驗動物每日經(jīng)口給藥1次,連續(xù)2 d,于第2天給藥后6 h處死動物,取兩側(cè)股骨骨髓,常規(guī)制片,Giemsa染色,鏡下觀察,每只動物觀察10 000個嗜多染紅細(xì)胞,求出微核率。
選健康雄性小鼠50只,隨機(jī)分成5組,每組10只,試驗處理及給藥同上。給藥后5 d脫臼處死動物,取出的雙側(cè)附睪置于盛有2 mL生理鹽水的小燒杯中剪碎,4層擦鏡紙過濾后制成精子懸液,進(jìn)行精子計數(shù)、精子存活數(shù)和精子畸形檢查。精子計數(shù):取已制備好的精子懸液1滴灌入血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)池中,高倍顯微鏡下計數(shù)池中5個中方格中的精子數(shù),換算成1 mL精子懸液中的精子數(shù)即為每側(cè)附睪的精子數(shù)量。精子畸形率:取已制備好的精子懸液以1 000 r·min-1離心5 min,吸去上清液,剩余少量液體與沉淀搖勻后,取懸液1滴置于潔凈載玻片一側(cè),推片,晾干后甲醇固定5 min,干后用2%伊紅水溶液染色1 h,在高倍顯微鏡下檢查精子形態(tài),每只鼠檢查完整精子1 000個,計算畸形率。
利用Excel 2010和DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。
小鼠經(jīng)口給予15 000 mg·kg-1澤蘭平菇后,動物出現(xiàn)靜臥,飲食活動減少,8 h后逐漸恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d動物無死亡(表1)。結(jié)果表明,雌雄性小鼠經(jīng)口急性毒性LD50>15 000 mg·kg-1,按照GB 15193.3—2003,澤蘭平菇屬無毒物質(zhì)。
表1 不同小鼠性別的經(jīng)口急性毒性
試驗各組血常規(guī)、血生化及臟器系數(shù)檢查均未見異常(表3~5)。澤蘭平菇大劑量組及普通平菇組小鼠喂養(yǎng)2周后被毛蓬松,體重增長緩慢,與對照組相比有顯著性差異(表2);小鼠解剖觀察可見胃內(nèi)容物較少,且呈黏液狀;病理組織學(xué)檢查胃黏膜細(xì)胞萎縮,黏膜層輕度變薄,炎細(xì)胞輕度增多,但未累及黏膜肌層。未見澤蘭平菇有明顯的毒性作用。
表2 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的體重情況
表3 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的血常規(guī)
表4 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的血生化指標(biāo)
表5 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的臟器系數(shù)
澤蘭平菇各組微核率為0.17%~0.19%,陰性對照組為0.18%,澤蘭平菇各組與陰性對照組均無顯著性差異。而陽性對照組為1.94%,與陰性對照組相比有極顯著差異(表6)。結(jié)果表明,在本試驗條件下,澤蘭平菇對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率無明顯影響。
表6 紫莖澤蘭對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響
澤蘭平菇各組精子計數(shù)、精子存活率、精子畸形率與陰性對照組比較,均無顯著性差異,而陽性對照組與陰性對照組相比有顯著性差異(表7)。結(jié)果表明,在本試驗條件下,澤蘭平菇對小鼠精子畸形率無明顯影響。
表7 紫莖澤蘭對小鼠精子的影響
紫莖澤蘭是一種含有毒物質(zhì)的有害雜草,其主要有毒成分是佩蘭毒素、澤蘭苦內(nèi)脂、香豆精類、丹寧等[8]。可引起大鼠肝臟毒性及血生化的改變[9-10]。紫莖澤蘭醇提取物有一定胚胎毒性[11]。因此,利用紫莖澤蘭栽培食用菌的食品安全性問題就顯得至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示,小鼠經(jīng)口急性毒性LD50雌雄性動物均>15 000 mg·kg-1,按照GB 15193.3—2003進(jìn)行急性毒性試驗,澤蘭平菇屬無毒物質(zhì);小鼠30 d喂養(yǎng)試驗各組血常規(guī)、血生化及臟器系數(shù)檢查均未見異常;小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核和小鼠精子畸形試驗結(jié)果均為陰性,表明澤蘭平菇無致突變致畸作用。其原因可能是通過紫莖澤蘭前處理、高溫滅菌以及平菇自身含有的大量生物酶,將紫莖澤蘭有毒物質(zhì)降解,參與平菇生長的代謝過程,但其解毒機(jī)理有待深入研究。