基于生物信息數(shù)據(jù)研究腫瘤突變負(fù)荷在結(jié)腸癌中的臨床意義

趙棟燕，孫希珍，姚樹坤

結(jié)直腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率都很高[1]。近年來結(jié)腸癌的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)在發(fā)展中國(guó)家逐漸增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2030年新發(fā)病例將超過220萬，死亡人數(shù)將達(dá)到110萬[2]。雖然目前化療、手術(shù)、靶向治療、放療等多種治療方法可提高結(jié)腸癌患者的生存率并減少其復(fù)發(fā)，但晚期結(jié)腸癌患者5年生存率仍然很低[1]。因此，迫切需要新的治療方法來延長(zhǎng)患者的生命。最近在實(shí)體腫瘤的治療策略中，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫療法已成為最有前途的方法之一。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的治療，如結(jié)直腸癌、肺癌、黑色素瘤等[3-4]。然而，由于腫瘤的遺傳異質(zhì)性，僅有小部分患者對(duì)免疫治療呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。因此亟待可靠的生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)免疫治療的療效。

腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden, TMB)是指體細(xì)胞基因非同義突變的分布密度，即外顯子編碼區(qū)域內(nèi)每Mb堿基中編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失的總數(shù)。目前TMB被認(rèn)為是免疫檢查點(diǎn)抑制劑的新型生物標(biāo)志物，能夠預(yù)測(cè)免疫治療的療效[5]。有研究表明，具有較高突變負(fù)荷的腫瘤能夠在腫瘤細(xì)胞表面募集到更多的新抗原，增加腫瘤的免疫原性，從而提高免疫治療的療效[6]。然而，結(jié)腸癌中關(guān)于TMB的研究較少。因此本研究應(yīng)用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas, TCGA)探討結(jié)腸癌的基因突變特征及TMB在結(jié)腸癌中的臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料獲取 通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫下載結(jié)腸癌患者399例的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)。體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)經(jīng)過VarScan軟件處理，并使用R軟件(版本3.6.1)的maftools函數(shù)包進(jìn)行特征性分析與可視化。

1.2 TMB的計(jì)算及預(yù)后分析 通過基于JAVA8平臺(tái)的Perl腳本計(jì)算每個(gè)樣本的TMB值，表達(dá)為體細(xì)胞突變總數(shù)/測(cè)序區(qū)域大小，單位為mutations/Mb。接著對(duì)TMB值降序排列，按中位數(shù)將所有腫瘤樣本分為高TMB組及低TMB組，根據(jù)每個(gè)樣本的臨床數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)分析TMB與總生存率的關(guān)系。應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析TMB值與臨床病理參數(shù)如性別、年齡、腫瘤分期、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等的關(guān)系。

1.3 基因富集分析 根據(jù)TMB中位數(shù)將基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分為高低2組，通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)軟件進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)和GO(gene oncology)富集分析，設(shè)定隨機(jī)組合次數(shù)為1 000 次。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(NES)>1、標(biāo)準(zhǔn)化顯著性水平(NOM)P<0.05和矯正多重假設(shè)檢驗(yàn)(FDR)q<0.25,則認(rèn)為富集的基因集有臨床意義。

1.4 TMB與浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞 基于RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)，本研究使用CIBERSORT函數(shù)定量分析每個(gè)腫瘤樣品中22種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的豐度，閾值設(shè)置為P<0.05。應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析高TMB組與低TMB組浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的占比差異，并通過vioplot函數(shù)包進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，對(duì)比分析2組之間CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、M1巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)表面標(biāo)記的差異，免疫細(xì)胞標(biāo)記從R&D Systems獲取(https://www.rndsystems.com/cn/resources/cell-markers/immune-cells)。

1.5 TMB與免疫檢查點(diǎn)分子 應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)比高TMB組與低TMB組之間免疫檢查點(diǎn)分子，包括程序性死亡受體1(PD-1)、程序性死亡受體配體1(PD-L1)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)的基因表達(dá)差異，應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析研究TMB值與免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)量之間的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析2組之間的差異，采用Kaplan-Meier法與log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。應(yīng)用R軟件(版本3.6.1)及GraphPad Prism 8進(jìn)行圖像繪制。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌基因突變數(shù)據(jù) 399個(gè)結(jié)腸癌樣本中有398個(gè)樣本存在變異，變異數(shù)0～7 278，中位數(shù)96。錯(cuò)義突變和單核苷酸多態(tài)性是最常見的突變類型，突變率最高的單核苷酸變異是C>T(圖1A)。瀑布圖顯示突變率最高的前10位基因是APC、TP53、TTN、KRAS、SYNE1、PIK3CA、MUC16、FAT4、ZFHX4、RYR2(圖1B)。

注：A.突變信息概況；(a).突變類別；(b).變異類型；(c).單核苷酸變異類型；(d).每個(gè)樣本的突變數(shù)目；(e).突變類別概況；(f).十大突變基因；B.結(jié)腸癌前30個(gè)突變基因的瀑布圖；SNV.單核苷酸變異；SNP.單核苷酸多態(tài)性；INS.插入；DEL.缺失

2.2 TMB在結(jié)腸癌中的預(yù)后價(jià)值 根據(jù)TMB中位數(shù)(3.132 mutations/Mb)將結(jié)腸癌樣本分為高TMB組(n=207)和低TMB組(n=192)，通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，發(fā)現(xiàn)高TMB組患者的生存率明顯低于低TMB組患者(χ2= 5.351，P=0.021)，高TMB組的5年生存率為0.574(95%CI0.468～0.703)，而低TMB組患者的5年生存率為0.632(95%CI0.507～0.789)。另外，比較TMB在不同亞組間的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在年齡>65歲、BMI>28 kg/m2、腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結(jié)和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中TMB表達(dá)較高(P<0.05)，在性別、T分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

注：A.結(jié)腸癌患者TMB與總生存率的關(guān)系；B～H.結(jié)腸癌患者TMB值與性別、年齡、BMI、臨床分期等臨床特征的相關(guān)性分析

2.3 基因富集分析 GSEA分析提示共有18個(gè)KEGG通路(圖3A)及336個(gè)GO通路(圖3B，僅展示前20 個(gè)通路)在高TMB組中有不同程度的富集。這些通路及生物過程多與免疫相關(guān)：Toll樣受體信號(hào)通路、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、B細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、淋巴細(xì)胞凋亡過程等。

注：A.KEGG通路；B.GO通路

2.4 TMB與浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的關(guān)系 高TMB組的患者CD8+T細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞及M1巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度明顯高于低TMB組(Z/P=-2.151/0.032，-1.988/0.047，-3.090/0.002，-2.783/0.005)，低TMB組Treg和M0巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度明顯高于高TMB組(Z/P=-2.494/0.013，-2.114/0.035)，見圖4。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，分析了高TMB組與低TMB組之間免疫細(xì)胞表面標(biāo)記的基因差異， 發(fā)現(xiàn)2組Treg的表面標(biāo)記FOXP3與CCR8基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z/P=-0.309/0.757，-0.732/0.464)，M1巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記NOS2、CD80和CD86在高TMB組明顯升高(Z/P=-3.006/0.003，-2.710/0.007，-2.167/0.030)，CD8+T細(xì)胞的表面標(biāo)記CD8A在高TMB組表達(dá)升高(Z/P=-3.242/0.001)，NK細(xì)胞的表面標(biāo)記KIR3DL1和CD7在高TMB組的基因表達(dá)水平顯著高于低TMB組(Z/P=-2.085/0.037，-3.498/<0.001)，見圖5。

圖4 2組22種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的表達(dá)比較

圖5 2組CD8+ T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和NK細(xì)胞基因標(biāo)記的表達(dá)差異

2.5 TMB與免疫檢查點(diǎn)分子的關(guān)系 在高TMB組中，免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、PD-L1和CTLA-4的基因表達(dá)水平顯著高于低TMB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z/P=-3.489/<0.001,-4.813/<0.001,-3.363/<0.001)。相關(guān)分析結(jié)果表明，在結(jié)腸癌患者中，TMB值與PD-1、PD-L1與CTLA-4的基因表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r/P=0.24/0.01,0.35/<0.01,0.25/<0.01)，但相關(guān)性不強(qiáng)，見圖6。

注：A.2組免疫檢查點(diǎn)分子的基因表達(dá)差異；B.結(jié)腸癌患者TMB與免疫檢查點(diǎn)分子的相關(guān)性分析

3 討 論

近年來，癌癥的治療策略發(fā)生了巨大變化，新型治療方法包括免疫治療在內(nèi)取得了較大成果。隨著治療策略的變化，具有臨床可行性的腫瘤生物標(biāo)志物已經(jīng)從影像學(xué)資料向基因轉(zhuǎn)變。既往研究揭示了幾種新型生物標(biāo)志物用來預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果，如PD-1/PD-L1表達(dá)、錯(cuò)配修復(fù)缺陷、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞[7]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，腫瘤突變負(fù)荷作為一種可能識(shí)別免疫治療反應(yīng)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物受到了巨大的關(guān)注。已有研究證實(shí)具有高突變負(fù)荷的腫瘤如膀胱癌與肺癌對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑有較好的反應(yīng)[4, 8]。因此,探索腫瘤突變負(fù)荷在結(jié)腸癌中發(fā)揮的作用及其與臨床預(yù)后的關(guān)系具有重要意義。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)義突變、單核苷酸多態(tài)性及C>T突變是結(jié)腸癌最常見的突變類型，而這些突變類型在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。突變率最高的前3個(gè)基因是腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(APC)、TP53、肌聯(lián)蛋白(TTN)。APC與TP53均為抑癌基因，其突變可促進(jìn)結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)變，被認(rèn)為是結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)鍵[9]。TTN是目前已知最長(zhǎng)的基因，已經(jīng)證實(shí)TTN與TMB表達(dá)水平的高低及免疫治療的反應(yīng)密切相關(guān)[10]。研究這些高突變的基因在結(jié)腸癌中的作用，對(duì)于明確結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制、進(jìn)展過程有重大意義。

在結(jié)腸癌中，TMB與患者的生存狀況及臨床病理特征之間的關(guān)系尚未明確。筆者以TMB的中位數(shù)(3.132 mutations/Mb)作為分界線，將結(jié)腸癌患者分為高TMB組和低TMB組，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)高TMB組的患者預(yù)后明顯差于低TMB組，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，筆者分析了不同臨床亞組間TMB的差異。突變負(fù)荷升高不僅多見于高齡肥胖的患者，還見于腫瘤早期、無淋巴結(jié)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。腫瘤早期患者生存期應(yīng)該較長(zhǎng)，但此處卻出現(xiàn)相反的結(jié)果，這可能與患者接受的治療措施不同有關(guān)，遺憾的是此數(shù)據(jù)庫并未提供每個(gè)樣本的具體治療方法。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)是一種已建立的用來預(yù)測(cè)免疫治療效果的生物指標(biāo)，其特征是錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺陷。有研究表明，在高M(jìn)SI的結(jié)腸癌中，突變負(fù)荷越高，患者越容易受益于免疫治療，患者預(yù)后越佳[11]。在一個(gè)小樣本結(jié)腸癌研究中，以6 mutations/Mb為臨界線劃分高低突變組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高突變負(fù)荷組患者化療效果優(yōu)于低突變負(fù)荷組，生存期延長(zhǎng)[12]?？梢钥闯?，在這些研究中，高TMB是結(jié)腸癌的良好預(yù)后因素。筆者的研究結(jié)果與既往研究不同，可能是因?yàn)樗扇〉闹委煼椒ú煌?。另外，TMB在不同腫瘤的預(yù)后價(jià)值也存在著較大的爭(zhēng)議。在腎透明細(xì)胞癌與前列腺癌研究中，同樣以中位數(shù)為界線劃分高低負(fù)荷組，高突變負(fù)荷組的患者往往伴隨著較差的預(yù)后[13- 14]；在肝細(xì)胞癌患者中，突變負(fù)荷對(duì)患者的預(yù)后沒有影響[15]；而在膀胱癌患者中，突變負(fù)荷越高則意味著患者生存時(shí)間越長(zhǎng)[16]。因此，需要大樣本的研究來明確突變負(fù)荷在不同腫瘤預(yù)后中的影響。

目前，腫瘤突變負(fù)荷在結(jié)腸癌中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。在基因富集分析的結(jié)果中，高突變負(fù)荷組的富集通路多與免疫相關(guān)。有研究表明，腫瘤細(xì)胞的突變負(fù)荷表達(dá)增加，可促進(jìn)細(xì)胞表面的新抗原積聚，增加其自身免疫原性，從而激活免疫細(xì)胞及其介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)[6]。在腫瘤微環(huán)境中，浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞占很大比例，它們通過釋放炎性細(xì)胞因子和趨化因子與腫瘤細(xì)胞相互作用，驅(qū)動(dòng)癌癥的生物學(xué)行為。因此，有必要探索突變負(fù)荷與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的潛在聯(lián)系。在高TMB患者中，CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞及M1巨噬細(xì)胞的占比顯著高于低TMB組，其基因標(biāo)志的表達(dá)在2組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些細(xì)胞均在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。有研究證實(shí)，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1可抑制CD8+T細(xì)胞，從而促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[17]。CD4+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫機(jī)制中的重要組成部分，并且與抗原處理過程密切相關(guān)，被認(rèn)為是多種腫瘤的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[18-19]。NK細(xì)胞在高TMB組顯著增多，而基因富集結(jié)果提示高TMB組在NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路中明顯富集，進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)果。巨噬細(xì)胞在腫瘤中的作用取決于自身的極化狀態(tài)。M1巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤的特性，而M2巨噬細(xì)胞則促進(jìn)腫瘤的增長(zhǎng)[20]。在高TMB組患者中，M0巨噬細(xì)胞占比下降，而M1巨噬細(xì)胞升高，可能的解釋是突變負(fù)荷升高促進(jìn)腫瘤細(xì)胞釋放某些因子誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞向M1極化。Treg與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，能夠有效地抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[21]。雖然Treg在低突變負(fù)荷組顯著升高，但是其標(biāo)志基因在2組之間卻無明顯差異，因此TMB與Treg之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。從上述可知，在高突變負(fù)荷的結(jié)腸癌患者中，腫瘤微環(huán)境呈現(xiàn)出明顯的抗腫瘤免疫狀態(tài)。未來可以從腫瘤微環(huán)境入手，進(jìn)一步探索TMB在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制。

本研究還探討了突變負(fù)荷與免疫檢查點(diǎn)分子之間的關(guān)系。免疫檢查點(diǎn)分子是一類能夠調(diào)控免疫細(xì)胞，在免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)蛋白，其中常見的是PD-1、PD-L1與CTLA-4。免疫檢查點(diǎn)分子能夠抑制免疫細(xì)胞特別是T細(xì)胞的活化及其產(chǎn)生的抗腫瘤反應(yīng)，從而使腫瘤逃避免疫監(jiān)視[22]。在結(jié)腸癌中，筆者發(fā)現(xiàn)高TMB組患者免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、PD-L1與CTLA-4的基因表達(dá)均明顯增高，提示免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用于這一類患者可能有效地恢復(fù)腫瘤微環(huán)境的免疫應(yīng)答，取得良好的治療效果。既往研究表明，在大多數(shù)腫瘤中PD-L1表達(dá)與突變負(fù)荷相互獨(dú)立[8]。在結(jié)腸癌中，TMB與免疫檢查點(diǎn)分子的基因表達(dá)相關(guān)性較弱，提示TMB在結(jié)腸癌中是獨(dú)立于PD-L1的生物標(biāo)志物。

本研究存在一些不足之處，僅納入了TCGA這一個(gè)數(shù)據(jù)庫，沒有采用外部數(shù)據(jù)庫如GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus database)或其他大樣本的隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證；在本研究中，筆者以中位數(shù)為臨界值區(qū)分高低突變負(fù)荷組，然而，如何定義突變負(fù)荷的高低水平并沒有定論。在一項(xiàng)大樣本多腫瘤的研究中，研究者將TMB分為3個(gè)亞組：高TMB組(占患者總數(shù)的50%)、中TMB組(占比40%)、低TMB組(占比10%)[23]。另外一項(xiàng)大規(guī)模研究中，研究人員將前20%TMB的患者定義為高突變負(fù)荷組，分析了在多種腫瘤中TMB與免疫療效之間的關(guān)系[24]。TMB的閾值也會(huì)受到其他因素的影響，如腫瘤類型、樣本類型、檢測(cè)方法、樣本采集過程等[22]。單純地以中位數(shù)作為臨界來劃分高低突變負(fù)荷并不十分科學(xué)，需要進(jìn)行關(guān)于免疫治療的大樣本臨床研究，以患者的療效作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)來尋找一個(gè)能夠在臨床上進(jìn)行推廣的臨界值。另外，筆者分析了TMB與浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的關(guān)系，但并沒有進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞和分子水平探索TMB對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。未來可以從這個(gè)方向出發(fā)深入研究，可能會(huì)為結(jié)腸癌的治療提供新的方向。

綜上所述，高TMB患者總生存時(shí)間短于低TMB的患者。突變負(fù)荷升高可引起腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的成分發(fā)生明顯變化，并產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。另外，突變負(fù)荷表達(dá)升高伴隨著免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、PD-L1與CTLA-4的基因表達(dá)增高，這些結(jié)果均提示高TMB患者更有可能受益于免疫治療。因此，TMB有望成為結(jié)腸癌預(yù)后及免疫治療的生物標(biāo)志物，為結(jié)腸癌的免疫治療提供新的研究方向。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙棟燕：設(shè)計(jì)研究方案，統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫；孫希珍：統(tǒng)計(jì)分析，論文修改；姚樹坤：課題設(shè)計(jì)，論文終審