血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs水平與特發(fā)性肺纖維化患者肺功能及預(yù)后的關(guān)系

丁麗麗，蔡暖暖，陳麗瑾，吳海洪，謝甜

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不明原因?qū)е碌倪M(jìn)行性肺間質(zhì)纖維化疾病，病理特征以彌漫性肺細(xì)胞炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂為主，患者肺功能呈限制性通氣功能障礙，氣體交換下降，臨床缺乏有效的救治手段，預(yù)后極差，病死率高，多數(shù)患者確診后2～5年內(nèi)死亡[1]。了解與IPF預(yù)后相關(guān)指標(biāo)有助于早期預(yù)測(cè)患者預(yù)后，改進(jìn)治療措施。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是人體重要的促炎細(xì)胞因子，近期研究顯示，HMGB1異常激活與肺纖維化發(fā)病機(jī)制有關(guān)[2]。潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(latent transforming growth factor β-binding protein-2，LTBP2)是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，在胚胎發(fā)生、修復(fù)動(dòng)脈損傷、細(xì)胞黏附及彈性纖維凝聚等過程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是纖維化失調(diào)相關(guān)基因蛋白[3]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)通過促使細(xì)胞外基質(zhì)分泌，致纖維化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，參與多種組織纖維化過程，AGE及其受體(RAGEs)參與肺纖維化進(jìn)程[4]?，F(xiàn)分析IPF患者血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs與肺功能和預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床診治提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5月—2018年3月海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治IPF患者102例(IPF組)，男62例，女40例，年齡57～73 (64.51±5.57)歲；病程6～25 (15.41±2.81)個(gè)月；合并呼吸衰竭21例；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)20.41～28.12 (24.84±3.01)kg/m2；吸煙史46例，飲酒史38例；改良版英國(guó)醫(yī)學(xué)研究會(huì)呼吸困難量表(MMRC)分級(jí)[5]：2級(jí)38例，3級(jí)41例，4級(jí)23例；有IPF家族史19例；均無明顯誘因。另選擇門診體檢健康者93例為健康對(duì)照組，均排除肺部感染、全身系統(tǒng)性疾病，男43例，女50例，年齡57～75 (64.68±5.43)歲；BMI 20.76～27.83 (24.06±2.97)kg/m2；吸煙史21例，飲酒史28例。2組受試者年齡、BMI、飲酒史比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IPF組男性、吸煙史比例高于健康對(duì)照組(P<0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者或其直系親屬均知曉本研究目的及內(nèi)容并簽署同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合“特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國(guó)專家共識(shí)”診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②首次確診IPF；③無肺部外傷史、結(jié)核史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并支氣管擴(kuò)張、肺部感染、肺氣腫、肺癌者；②合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重功能障礙；③IPF急性加重；④不配合隨訪，失訪者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清HMGB1、LTBP2、AGE、RAGEs檢測(cè)：IPF患者入院24 h內(nèi)、健康對(duì)照組體檢當(dāng)日采集空腹肘靜脈血3～5 ml，TDZ4-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)離心取血清保存于-80℃超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)。采用意大利BIOBASE2000型全自動(dòng)酶免分析儀，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清HMGB1、LTBP2、AGE、RAGEs 水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Epitope Diagnostics公司，計(jì)算AGE/RAGEs比值。

1.3.2 肺功能指標(biāo)檢測(cè)：以Master Screen肺功能儀檢測(cè)第1秒用力呼氣容積(FEV1)和用力肺活量(FVC)，計(jì)算FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計(jì)值百分?jǐn)?shù)(FEV1%pred)，1 min最大自主通氣量(MVV)、最大自主通氣量占預(yù)計(jì)值百分比(MVV%pred)、肺一氧化碳彌散量(DLco)，上述指標(biāo)測(cè)量3次，取最大值。

1.3.3 預(yù)后情況：所有IPF患者均采用電話或微信隨訪，隨訪至2020年3月，確診時(shí)間為起點(diǎn)，隨訪截止時(shí)間為終點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)隨訪期間IPF急性加重、肺并發(fā)癥(肺動(dòng)脈高壓、肺氣腫、呼吸衰竭等)、死亡事件發(fā)生情況，發(fā)生以上情況患者歸為預(yù)后不良亞組，未發(fā)生者歸為預(yù)后良好亞組。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清HMGB1、LTBP2、AGE、RAGEs、AGE/RAGEs水平比較 IPF組血清HMGB1、LTBP2、AGE、AGE/RAGEs比值高于健康對(duì)照組(P<0.01)，RAGEs低于健康對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

表1 2組受試者血清HMGB1、LTBP2、AGE、RAGEs、AGE/RAGEs水平比較

2.2 2組肺功能指標(biāo)比較 IPF組FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred、MVV、MVV%pred、DLco低于健康對(duì)照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組受試者肺功能指標(biāo)比較

2.3 IPF患者2亞組血清HMGB1、LTBP2、AGE、RAGEs、AGE/RAGEs水平比較 截止末次隨訪，IPF患者發(fā)生IPF急性加重18例，肺動(dòng)脈高壓12例，肺氣腫15例，呼吸衰竭3例，死亡2例。預(yù)后不良亞組血清HMGB1、LTBP2、AGE、AGE/RAGEs比值高于預(yù)后良好亞組(P<0.05)，RAGEs低于預(yù)后良好亞組(P<0.01)，見表3。

表3 2亞組患者血清HMGB1、LTBP2、AGE、RAGEs、AGE/RAGEs水平比較

2.4 IPF患者血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs 水平與肺功能相關(guān)性 IPF患者血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs水平與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred、MVV、MVV%pred、DLco呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 IPF患者血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs水平與肺功能相關(guān)性

2.5 血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs預(yù)測(cè)IPF預(yù)后的效能 ROC分析血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs預(yù)測(cè)IPF預(yù)后的曲線下面積(AUC)分別為0.744(95%CI0.576～0.960)、0.706(95%CI0.547～0.911)、0.691(95%CI0.490～0.975)，聯(lián)合血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs可提高對(duì)IPF預(yù)后的預(yù)測(cè)效能，AUC為0.802(95%CI0.664～0.969)，大于血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs單獨(dú)預(yù)測(cè)，見圖1。血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs預(yù)測(cè)IPF預(yù)后的Cut-off值、AUC、敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值見表5。

表5 血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs預(yù)測(cè)IPF預(yù)后的效能

圖1 HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs預(yù)測(cè)IPF預(yù)后的ROC分析

3 討 論

IPF是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性肺部疾病，全球范圍約300萬IPF患者，發(fā)病率隨年齡升高顯著增加[7]。由于肺正常組織被細(xì)胞外基質(zhì)取代，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺順應(yīng)性下降，氣體交換中斷，患者可逐漸出現(xiàn)呼吸衰竭和死亡[8-10]。IPF病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前公認(rèn)的機(jī)制包括反復(fù)的肺泡上皮損傷，轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)、血小板衍化生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促纖維化細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，成纖維細(xì)胞活化和增殖，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過量產(chǎn)生，發(fā)生異常纖維化。與肺纖維化相關(guān)的分子生物標(biāo)志物可能反映疾病活動(dòng)度，有望為IPF早期診斷、預(yù)后評(píng)估、個(gè)性化治療提供參考[11-12]。目前缺乏IPF預(yù)后評(píng)估的有效方法和指標(biāo)，肺部CT在IPF診斷中具有一定價(jià)值，但無法早期發(fā)現(xiàn)IPF微小病變，對(duì)預(yù)后評(píng)估價(jià)值不大，血清學(xué)指標(biāo)無創(chuàng)，可重復(fù)檢測(cè)，在IPF預(yù)后評(píng)估中頗具前景。

HMGB1是一種DNA結(jié)合蛋白，通過與DNA結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等生理功能，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)炎性介質(zhì)被激活，HMGB1通過活化主動(dòng)分泌或壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放形式從細(xì)胞核中進(jìn)入外周血循環(huán)，發(fā)揮刺激炎性反應(yīng)、趨化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、代謝等功能[13-15]。Chirico等[16]報(bào)道，血清HMGB1水平在肺纖維化患者中明顯升高，并且HMGB1水平越高，肺功能下降越快。本研究結(jié)果表明，IPF患者血清HMGB1水平顯著升高，而肺通氣和彌散功能指標(biāo)降低，說明血清HMGB1水平能夠反映IPF肺功能實(shí)質(zhì)損害進(jìn)展。本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)，IPF預(yù)后不良者血清HMGB1水平高于預(yù)后良好者，提示HMGB1可作為IPF預(yù)后評(píng)估的潛在生物學(xué)指標(biāo)。HMGB1參與IPF的機(jī)制可能為：HMGB1通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體、Toll樣受體結(jié)合激活核因子-κB通路，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇炎性反應(yīng)，介導(dǎo)肺損傷過程[17]。動(dòng)物研究顯示，敲除HMGB1后，致纖維化因子TGF誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型平滑肌肌動(dòng)蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)受到抑制，HMGB1表達(dá)受miR-627調(diào)控，miR-627通過與HMGB1的3′未翻譯區(qū)結(jié)合抑制HMGB1表達(dá)，miR-627/ HMGB1/ NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路參與肺纖維化進(jìn)程[18]。

LTBP2 是TGF小分子結(jié)合蛋白，在肺、皮膚和大血管中表達(dá)，作為TGF-β潛在復(fù)合物在細(xì)胞黏附、損傷修復(fù)、彈性纖維凝聚等病理生理過程中發(fā)揮重要作用，參與多個(gè)器官纖維化或組織重塑[19]。LTBP2在肺纖維化中的作用機(jī)制尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者血清LTBP2水平升高，LTBP2與肺通氣和彌散功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，說明LTBP2表達(dá)與IPF肺功能惡性進(jìn)展有關(guān)。Enomoto 等[20]報(bào)道顯示，肺纖維化組織中LTBP2表達(dá)上調(diào)，IPF急性加重時(shí)增生間質(zhì)平滑肌細(xì)胞和非成纖維細(xì)胞灶肌纖維母細(xì)胞LTBP2表達(dá)進(jìn)一步升高，LTBP2與IPF患者FVC呈負(fù)相關(guān)，可預(yù)測(cè)IPF患者呼吸事件相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，LTBP2在IPF不同預(yù)后患者中差異顯著，說明LTBP2可作為IPF患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。一項(xiàng)體外研究顯示，LTBP2通過與纖顫蛋白1結(jié)合與LTBP1競(jìng)爭(zhēng)，間接參與了促纖維化生長(zhǎng)因子的存儲(chǔ)和激活[21]。LTBP2可直接上調(diào)TGF- 271表達(dá)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，成纖維細(xì)胞與纖維連接蛋白黏附，導(dǎo)致肺纖維化[22]。提示LTBP2可作為IPF持續(xù)纖維化和急性加重的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)。

RAGE是一種免疫球蛋白超家族蛋白，在肺組織中高表達(dá)，通過細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)跨膜區(qū)直接分泌到ECM，參與維持肺泡結(jié)構(gòu)、Ⅰ型肺泡細(xì)胞的生存發(fā)育和分化。AGE是還原糖單糖與蛋白游離氨基非酶反應(yīng)的產(chǎn)物，通過作用于細(xì)胞和ECM蛋白交聯(lián)信號(hào)通路促使創(chuàng)面異常愈合，改變膠原纖維理化性質(zhì)和組織硬度[23]。RAGE與AGE結(jié)合后阻斷AGE細(xì)胞信號(hào)通路，減弱RAGE作用，AGE/RAGE信號(hào)通路參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[24]。本研究結(jié)果顯示，IPF患者中存在AGE/RAGEs失衡，AGE水平升高，RAGEs降低，提示RAGE作用受到抑制。本研究結(jié)果表明，AGE/RAGEs與肺功能同樣存在顯著相關(guān)性，AGE/RAGEs過度增高可能導(dǎo)致IPF持續(xù)肺纖維化和肺功能下降進(jìn)程。RAGE可阻斷TGF-β誘導(dǎo)的Smad2、ERK和JNK信號(hào)激活，抑制上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[4]，提示RAGE表達(dá)缺失可能介導(dǎo)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，導(dǎo)致纖維化。HMGB1作為RAGE配體，通過激活磷酸化的絲分裂原活化蛋白激酶1/2、磷酸化的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和pc-Jun信號(hào)通路，刺激肝臟星狀細(xì)胞遷移，通過RAGE信號(hào)上調(diào)Ⅰ型膠原表達(dá)和沉積，促使肝纖維化進(jìn)程[25]。各種病理生理?xiàng)l件下肺組織RAGE及其配體AGE、HMGB1相互作用，介導(dǎo)了炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致了IPF、急性肺損傷、囊性纖維化的發(fā)生[26]。

ROC分析結(jié)果顯示，血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs預(yù)測(cè)IPF患者預(yù)后均具有一定價(jià)值，聯(lián)合3項(xiàng)指標(biāo)可提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，其預(yù)測(cè)的敏感度和特異度均較高，提示三者聯(lián)合檢測(cè)可以較為準(zhǔn)確地評(píng)估IPF患者預(yù)后。

綜上，IPF患者血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs水平升高，高HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs水平與IPF患者肺功能低下有關(guān)。血清HMGB1、LTBP2、AGE/RAGEs持續(xù)升高可能導(dǎo)致IPF病情進(jìn)展，可為IPF患者預(yù)后評(píng)估提供參考。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

丁麗麗：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；蔡暖暖、陳麗瑾：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；吳海洪：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；謝甜：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析