任 崴，黃廷林

(1.西安建筑科技大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院 陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710055;2.河南科技大學(xué) 建筑學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

飲用水安全問題關(guān)系到人類生命健康[1-2]，近年來，隨著檢測(cè)技術(shù)的提高和改進(jìn)，飲用水中微生物的安全性受到更多的關(guān)注[3]，其中由真菌的繁殖帶來的飲用水污染問題日趨普遍，逐漸受到重視[4].真菌在水源水中的生長(zhǎng)不僅影響到了水體嗅覺[5]和味覺[6]上的不適，使水處理工藝變得復(fù)雜，而且其中致病性及潛在致病性菌的積累容易導(dǎo)致流行性疾病的發(fā)生[7].目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)真菌群落多樣性及其潛在致病性研究多集中于土壤[8]、地表水[9]、自來水[10]、醫(yī)院供水系統(tǒng)[11]等環(huán)境中，而對(duì)地下水源水中真菌污染的研究相對(duì)較少[12].

可培養(yǎng)微生物通常只占環(huán)境微生物總數(shù)的極小部分，傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法只能反映出部分的微生物信息[13]，很難反映出環(huán)境中微生物多樣性的原始狀態(tài)[14].目前利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)這一分子生物學(xué)方法[15]對(duì)水環(huán)境中的真菌多樣性研究已有報(bào)道，邸詩(shī)雨等[9]對(duì)西安市典型景觀水體水質(zhì)與微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性研究發(fā)現(xiàn)不同水體真菌菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，莖點(diǎn)霉屬(Phomasp.)真菌是分布在城市景觀水體中的優(yōu)勢(shì)種群.王風(fēng)芹等[16]對(duì)賈魯河水體微生物菌群結(jié)構(gòu)季節(jié)動(dòng)態(tài)變遷研究發(fā)現(xiàn)賈魯河水體和底泥中細(xì)菌數(shù)量顯著高于真菌和放線菌數(shù)量，水體中各類群微生物數(shù)量夏秋季高于冬春季，而底泥中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量春夏季略高于秋冬季.宣淮翔等[17]研究了太湖不同湖區(qū)水生真菌多樣性發(fā)現(xiàn)子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為優(yōu)勢(shì)種群，聚類及典型相關(guān)分析表明，太湖不同湖區(qū)水生真菌多樣性存在差異，這與湖區(qū)間不同的營(yíng)養(yǎng)水平、風(fēng)浪擾動(dòng)狀況等因素有關(guān).張利蘭[18]對(duì)豫北黃河故道、山東黃河三角洲和河北白洋淀三個(gè)不同類型的濕地水體研究發(fā)現(xiàn)真菌主要分布?jí)鼐V(Chytridiomycetes 16.2%)，黑粉菌綱(Ustilaginomycetes 5.4%)，接合菌綱(Zygomycetes 2.7%)和繡菌綱(Urediniomycetes 21.6%)，三個(gè)濕地共有類群為Urediniomycetes，但分布在其不同的種屬.

西北某市屬暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，夏季炎熱多雨，每到夏季高溫時(shí)節(jié)，其常規(guī)水廠的地下水源水中真菌會(huì)大量繁殖，形成以絲狀菌、放線菌等為主的微生物絮體，堵塞管道，增大水處理設(shè)施的負(fù)荷.本研究利用PCR-DGGE分子指紋圖譜技術(shù)探究供水系統(tǒng)中真菌種屬多樣性、變化規(guī)律、優(yōu)勢(shì)種屬等進(jìn)行了對(duì)比分析，為進(jìn)一步研究地下水源井中真菌污染控制等方面提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)概況

課題組研究對(duì)象西北某市北郊地下水源地共有54口井，常態(tài)化運(yùn)行的有32口井[19].本研究在選取其中12個(gè)具有代表性的地下水源井為研究對(duì)象(表1).

表1 12個(gè)水源井概況

1.2 樣品采集

2014年6月采集12個(gè)地下水樣品，每個(gè)水樣均取5 L用于水質(zhì)分析和微生物群落結(jié)構(gòu)分析，全程無菌操作.

1.3 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定參照環(huán)保部出版的《水與廢水監(jiān)測(cè)方法》第四版中的標(biāo)準(zhǔn)方法，詳見表2.

表2 水質(zhì)分析方法及所用儀器

1.4 水體微生物總DNA提取

所用試劑盒為E.Z.N.A.?water DNA Kit(D5525)，美國(guó)OMEGA生物公司.主要步驟參考試劑盒使用說明書及王帥[20]論文中的方法

1.5 巢式PCR擴(kuò)增和DGGE分析

實(shí)驗(yàn)中所用引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[9, 21]，詳見表3.DGGE圖譜采用Quantity One軟件分析.

表3 真菌巢式PCR引物及條件

1.6 克隆測(cè)序

參照WU等的方法[22].

1.7 數(shù)據(jù)分析

Quantity One分析軟件(Version 4.3.1，美國(guó)Bio-Rad公司)分析指紋圖譜.軟件分析所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行真菌多樣性分析.

真菌的多樣性水平采用如下指數(shù)考查:

Shannon多樣性指數(shù)

H=-∑PilnPi

在盾構(gòu)完成穿越橋梁樁基后，對(duì)穿越高鐵影響范圍內(nèi)的管片，利用管片上的注漿孔自下而上進(jìn)行二次注漿，漿液采取快速凝結(jié)的雙液漿，注漿壓力不大于0.4MPa，以確保管片壁后空隙填充飽滿。

Pielou均勻度指數(shù)

J=H/lnS

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)特征

12個(gè)地下水水質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)見表4.由數(shù)據(jù)可以看出，12個(gè)水樣的水溫在18.4～20.8之間，整體變化不大.pH值顯示水體呈弱堿性(8.38～8.78)，溶解氧濃度在8.0～10.5 mg/L之間，均在水環(huán)境正常范圍內(nèi).

表4 12個(gè)水體水質(zhì)指標(biāo)分析

根據(jù)地下水環(huán)境質(zhì)量(GB/T 14848-9)標(biāo)準(zhǔn)值(Ⅲ類)分析，12個(gè)水樣中Fe(7，34號(hào)井)和Mn(16，37，39號(hào)井)水樣超標(biāo).

2.2 DGGE 指紋圖譜分析

如圖1所示，DGGE圖譜中的條帶清晰，說明所選擇的生物樣本合適，樣本的稀釋梯度及DNA濃度滿足檢測(cè)的要求.在DGGE圖譜中，每個(gè)泳道對(duì)應(yīng)一個(gè)環(huán)境樣本，每個(gè)泳道中不同位置的光亮條帶代表一種真菌種屬，位置不同真菌種屬不同.多個(gè)泳道的同一位置的條帶可說明該位置的真菌種屬存在于每個(gè)環(huán)境樣本中，通過上述分析以及相關(guān)軟件根據(jù)條帶亮度和數(shù)量所賦值計(jì)算相應(yīng)的多樣性指數(shù).

圖1泳道比較圖中的百分?jǐn)?shù)(%)是其余泳道與第7泳道結(jié)構(gòu)的相似百分比.

如圖1所示：12個(gè)樣品通過巢式PCR-DGGE共分離出25個(gè)條帶，12個(gè)環(huán)境樣本的特征有相同點(diǎn)，也有不同，例如條帶6、14和16是12個(gè)樣品共有條帶，條帶23是第10(1)樣品的特有條帶.這說明真菌種屬分布有一定的規(guī)律，DGGE圖譜中，不同環(huán)境樣本所得的條帶數(shù)目并不相同，但對(duì)應(yīng)的真菌種屬有相同之處，說明一些真菌是多個(gè)環(huán)境樣本所共有的，而一些環(huán)境樣本中的某一條帶有唯一性，說明這個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的真菌種屬是別的環(huán)境樣本中所沒有的.

圖1 不同樣品真菌DGGE圖譜及泳道比較圖

2.3 真菌群落結(jié)構(gòu)相似性(Cs)分析

真菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析可以得出，34號(hào)井和36A號(hào)井樣品的相似度最高，達(dá)63.3%，說明這兩個(gè)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)相似程度比較高，而7號(hào)井和16號(hào)井樣品的相似度最低，為20.4%.通過UPGMA算法對(duì)不同樣點(diǎn)真菌菌群落結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如表4所示，由圖可知當(dāng)Cs小于0.4時(shí)，樣品分為4大族:7號(hào)井樣品單獨(dú)為一族，10(1)、41A、43和46號(hào)井樣品為第二族，其余樣品為第三族.不同樣品比較，相鄰樣品真菌群落相似性較高，聚類位置相近.

表6 樣品的相似性系數(shù)分析

2.4 真菌DGGE 條帶基因片段測(cè)序分析

通過圖譜分析，選擇環(huán)境樣本中的真菌種屬最多作為目標(biāo)條帶，編號(hào)，然后進(jìn)行割膠、測(cè)序.通過測(cè)序，將所測(cè)序結(jié)果與NCBI庫(kù)進(jìn)行表，相似度最高的已知真菌種屬極大可能就是該條帶對(duì)應(yīng)的真菌種屬[8]，詳見表7.

圖2 不同取樣點(diǎn)真菌群落結(jié)構(gòu)相似性的聚類分析

表7 DGGE條帶的序列比對(duì)分析

由表7可以看出，6條序列與GenBank中序列的最大相似度都在97%以上.

其中尖刀鏈胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)為12個(gè)水樣中共同存在的真菌種屬.

2.5 真菌與環(huán)境變量之間的相關(guān)關(guān)系

地下水體中的絲狀真菌來源及生長(zhǎng)繁殖是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能受到來至于氣候、降水、溫度、地表環(huán)境及人類活動(dòng)等方面的影響.但從另一方面分析，水體中的某些水質(zhì)指標(biāo)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能是影響其在水體中生長(zhǎng)繁殖的重要方面.

利用Excel 2003、Canaco 4.5等軟件分析地下水源井中的真菌與常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果如圖3所示.從圖3我們可以看出，真菌的生長(zhǎng)和常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)DO、pH、溫度、濁度、鐵、錳、TN、TP、氨氮、堿度、COD、TOC存在一定的相關(guān)性.不同種屬的真菌與環(huán)境變量的相關(guān)性并不相同.pH值和溫度和對(duì)鐮刀菌屬(Fusarium.sp)、青霉屬(Penicillium.sp)的生長(zhǎng)相關(guān)性較大.

圖3 真菌與環(huán)境變量之間的相關(guān)關(guān)系

3 討論

據(jù)推測(cè)，全世界的真菌種類約150萬(wàn)種，目前已經(jīng)得到鑒定的(包括陸生、水生等約80 000 種)僅占其全部種類的5%左右[23].其中絕大部分不能用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離的方法進(jìn)行研究.本文利用PCR-DGGE這一無需分離培養(yǎng)微生物的技術(shù)，來研究西北某市地下水源井水中真菌種群的分布特征.但該方法對(duì)于優(yōu)勢(shì)類群的一般只能鑒定到目或科，缺乏更為詳細(xì)的分類學(xué)信息，有一定的局限性[17].

西北某市地下不同的水源井中真菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為0.89～1.33、9～25 和0.405～0.460，表明該地區(qū)地真菌種類較為豐富，這與Elke等[24]人在對(duì)德國(guó)地下飲用水源的研究結(jié)論類似.影響水體中的真菌繁殖的因素很多，如溫度及碳、氮[25]等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]有關(guān).地下水是一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境，水源的補(bǔ)給相對(duì)復(fù)雜，由圖1 DGGE圖譜可以看出，不同的水源井水中既存在著共同的真菌種屬也有各自特異的種屬，說明不同的位置對(duì)其真菌種屬有一定的影響，張利蘭[18]對(duì)自然濕地水體真菌群落結(jié)構(gòu)研究表明地理位置對(duì)其真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分布是有明顯的影響的.

通過PCR-DGGE技術(shù)得出各樣品間的真菌群落相似性系數(shù)不盡相同，34號(hào)井和36A號(hào)井樣品的相似度最高，達(dá)63.3%，說明這兩個(gè)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)相似程度比較高，而7號(hào)井和16號(hào)井樣品的相似度最低，為20.4%.地下水的補(bǔ)給、循環(huán)和流動(dòng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不同水樣之間的差異可能和其所處的不同的含水層有關(guān).

同時(shí)，通過克隆測(cè)序得出的6條序列與GenBank中序列的最大相似度都在97%以上.其中尖刀鏈胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)為12個(gè)樣品中共同存在的真菌種屬，另外，有相當(dāng)一部分不可培養(yǎng)真菌存在于不同的水樣中，并且尖刀鏈胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)在純培養(yǎng)試驗(yàn)中并未培養(yǎng)出(文中未列出純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果).這也從另一方面佐證了PCR-DGGE技術(shù)作為研究微生物菌落組成及演化規(guī)律的有效方法[26].

地下水體中的絲狀真菌來源及生長(zhǎng)繁殖是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能受到來至于氣候、降水、溫度、地表環(huán)境及人類活動(dòng)等方面的影響.但從另一方面分析，水體中的某些水質(zhì)指標(biāo)及營(yíng)養(yǎng)條件可能是影響其在水體中生長(zhǎng)繁殖的重要方面[25].

利用Excel 2003、Canaco 4.5等軟件分析地下水源井中的真菌與常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果如圖3所示.從圖3可以看出，真菌的生長(zhǎng)和常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)DO、pH、溫度、濁度、鐵、錳、TN、TP、氨氮、堿度、COD、TOC存在一定的相關(guān)性.不同種屬的真菌與環(huán)境變量的相關(guān)性并不相同.pH值和溫度和對(duì)鐮刀菌屬(Fusarium.sp)、青霉屬(Penicillium.sp)的生長(zhǎng)相關(guān)性較大.Hamid Moh等人[25]的研究發(fā)現(xiàn)，真菌在C∶N比為1∶1時(shí)生長(zhǎng)最為迅速，此外，pH值為5.5～6.5與其他pH值相比，顯示出最佳的真菌生長(zhǎng)條件.

盡管PCR-DGGE技術(shù)對(duì)水處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律的研究有重要意義.但PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)的DNA片段受片段長(zhǎng)度的限制，對(duì)較長(zhǎng)的片段分離率下降，限制了用于系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量[27].不同類型真菌種群的rDNA有著相同的遷移行為，一條DGGE帶可能代表幾種菌，也可能不同的幾條DGGE帶代表同一種菌.另一方面，由于PCR、DGGE方法的靈敏度所造成的不能確定代謝活性、細(xì)菌數(shù)量和基因表達(dá)的水平等也是該技術(shù)的局限性.

4 結(jié)論

(1)西北某市地下水中真菌種類較為豐富，不同的水源井中既存在著共同的真菌種屬也有各自特異的種屬，真菌多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)分別為0.89～1.33、9～25 和0.405～0.460.

(2)對(duì)不同樣點(diǎn)真菌群落相似性進(jìn)行比較研究得出其相似性系數(shù)存在著一定的關(guān)系，相鄰樣點(diǎn)間相似性較高.顯示優(yōu)勢(shì)類群主要分布于隱球菌屬(Cryptococcussp.)、暗球腔菌屬(Pluteussp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)四種類型真菌普遍存在于地下水源井中，同時(shí)也是地下水真菌中的優(yōu)勢(shì)種類.

(3)真菌的生長(zhǎng)和常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)DO、pH、溫度、濁度、鐵、錳、TN、TP、氨氮、堿度、COD、TOC存在一定的相關(guān)性.不同種屬的真菌與環(huán)境變量的相關(guān)性并不相同.pH值和溫度和對(duì)鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)的生長(zhǎng)相關(guān)性較大.

(4)研究為地下水真菌污染控制提供了一定的理論依據(jù).