程 俠，吳毅彥，郝桂明，王 衛(wèi)

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

氨酚咖匹林片的主要成分為對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因和阿司匹林，是一種解熱鎮(zhèn)痛藥的非處方藥，對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚是對(duì)乙酰氨基酚原料藥含有的兩個(gè)主要雜質(zhì)，均是對(duì)乙酰氨基酚合成過(guò)程中引入的雜質(zhì)［1］，毒性較大［2-3］。為了保證藥品的安全，有必要控制對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚的含量，而氨酚咖匹林片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-10001（HD-1126）-2002-2009］和相關(guān)文獻(xiàn)中均沒(méi)有檢測(cè)這兩個(gè)雜質(zhì)含量的方法。本試驗(yàn)建立了一個(gè)HPLC 方法同時(shí)測(cè)定對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚的含量，旨在提高氨酚咖匹林片的質(zhì)量控制技術(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695 高效液相色譜儀，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、2998PDA 檢測(cè)器、Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；Mettler XPE105 電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥 對(duì)氯苯乙酰胺對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 100850-201803，含量：100%），對(duì)氨基酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100802-201203，含量：100%）；7 批氨酚咖匹林片樣品為抽驗(yàn)樣品，規(guī)格：阿司匹林0.226 8 g，咖啡因33.4 mg，對(duì)乙酰氨基酚 0.136 g（廠家 A，批號(hào) 2010080、2010082、2011086、2010081、2007077、2006069、2001009）；甲 醇（色譜純，默克公司）；水為超純水；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、25%四丁基氫氧化銨溶液均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACCHROM XUnion C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 為磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉8.95 g，磷酸二氫鈉3.9 g，加水溶解至1 000 ml，加25%四丁基氫氧化銨溶液4.8 ml），流動(dòng)相B 為甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液 精密稱取對(duì)氯苯乙酰胺對(duì)照品10.06 mg 和對(duì)氨基酚對(duì)照品20.19 mg 分別置20 0 ml 和 20 ml 量瓶中，分別加溶劑［水-甲醇（60∶40）］適量，振搖10 min，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚對(duì)照品貯備液；精密量取上述2 種對(duì)照品貯備液各10 ml 置同一100 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 精密量取混合對(duì)照品貯備液10 ml 置100 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液（約含對(duì)氯苯乙酰胺0.5 μg/ml，對(duì)氨基酚 10 μg/ml）。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚0.2 g），置20 ml 量瓶中，加溶劑10 ml，振搖10 min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 供試品加標(biāo)溶液 精密稱取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚0.2 g），置20 ml 量瓶中，精密加入混合對(duì)照品貯備液2.0 ml，加溶劑10 ml，振搖10 min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品加標(biāo)溶液。

2.2.5 空白溶液 水-甲醇（60∶40）溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取空白溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品加標(biāo)溶液及供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。對(duì)照品色譜圖中對(duì)氨基酚峰和對(duì)氯苯乙酰胺峰的理論板數(shù)分別為10 287 和118 364；供試品加標(biāo)溶液色譜圖中對(duì)氨基酚峰和對(duì)氯苯乙酰胺峰與各自相鄰峰均能分離良好，其中對(duì)氨基酚峰與其相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度為2.2，對(duì)氯苯乙酰胺峰與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度為3.3；空白無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白對(duì)照（A）混合對(duì)照品（B）供試品加標(biāo)（C）供試品（D）HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系與范圍 分別精密量取混合對(duì)照品貯備液 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 和 12.5 分別置 50 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品系列溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度C 為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)如下：對(duì)氯苯乙酰胺A=110 396 C-1 568.1（r=0.999 9）；對(duì)氨基酚 A=35 763 C-3 040.5（r=0.999 9）。結(jié)果表明：對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚分別在0.05~1.26 μg/ml 和 0.20~25.24 μg/ml 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢測(cè)限 取混合對(duì)照品貯備溶液，分別用溶劑逐級(jí)稀釋，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以信噪比S/N 值達(dá)到3 左右時(shí)計(jì)算檢測(cè)限，結(jié)果對(duì)氯苯乙酰胺為 0.025 μg/ml，對(duì)氨基酚為 0.01 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚峰面積的RSD 分別為0.2%和0.4%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取氨酚咖匹林片樣品（批號(hào)2007077）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚0.2 g）6 份，置20 ml量瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果對(duì)氨基酚的含量為0.001 9%，RSD 為0.84%，對(duì)氯苯乙酰胺未檢出，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，放置0、1、2、4、6、8、10 和 12 h 后，按上述色譜條件測(cè)定，對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚峰面積的RSD 分別為0.46%和1.78%（n=6），對(duì)氯苯乙酰胺在12 h 內(nèi)比較穩(wěn)定，但對(duì)氨基酚在4 h 后開(kāi)始出現(xiàn)降解現(xiàn)象。因此，溶液配制好后應(yīng)于低溫保存并盡快進(jìn)樣分析［4-5］。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的氨酚咖匹林片樣品（批號(hào)2010080）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚0.2 g）9 份，置20 ml 量瓶中，分別加入混合對(duì)照品貯備液 1.6、2.0 和 2.4 ml，每個(gè)濃度各 3 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別配制溶液，分別進(jìn)樣，結(jié)果對(duì)氨基酚平均回收率為100.34%，RSD 為0.63%；對(duì)氯苯乙酰胺平均回收率為100.72%，RSD 為1.35%。見(jiàn)表2 和表3。

表2 對(duì)氨基酚回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表3 對(duì)氯苯乙酰胺回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.10 樣品測(cè)定 對(duì)7 批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別配制供試品溶液，另取混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，并按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算兩個(gè)雜質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)氨基酚的含量測(cè)定結(jié)果均在其濃度線性范圍內(nèi)。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 《中國(guó)藥典》2015 年版二部中收載的對(duì)乙酰氨基酚原料藥［6］中“對(duì)氯苯乙酰胺”和“對(duì)氨基酚及有關(guān)物質(zhì)”的測(cè)定方法采用了兩個(gè)色譜系統(tǒng)來(lái)測(cè)定這兩個(gè)雜質(zhì)的含量，工作效率低且成本高。本方法在《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化了色譜條件，采用梯度洗脫的方法，在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)定對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚的含量，且在測(cè)定的7 批樣品色譜圖中對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚均能與相鄰的雜質(zhì)峰得到很好的分離。此方法專屬性好，線性、精密度和回收率良好，可快速測(cè)定氨酚咖匹林片中的對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚的含量。

3.2 溶液穩(wěn)定性 此次考查結(jié)果表明，常溫下對(duì)照品溶液中對(duì)氨基酚峰在4 h 后開(kāi)始出現(xiàn)降解趨勢(shì)，雖然對(duì)氨基酚峰的峰面積在12 h 內(nèi)的RSD＜2.0%，仍建議溶液配制好后于低溫保存并盡快進(jìn)樣分析。

3.3 樣品的測(cè)定 《中國(guó)藥典》2015 年版二部中收載的對(duì)乙酰氨基酚原料藥［6］中對(duì)氯苯乙酰胺和對(duì)氨基酚的限度均為0.005%，收載的對(duì)乙酰氨基酚片［6］中對(duì)氯苯乙酰胺的限度為0.005%，對(duì)氨基酚的限度為0.1%。此次考查的7 批樣品中，對(duì)氯苯乙酰胺均未檢出，其中有3 批檢出對(duì)氨基酚，但含量均小于0.05%，說(shuō)明這7批樣品對(duì)這兩個(gè)雜質(zhì)的質(zhì)量控制得較好。