伊氏線蟲真菌碳氮條件下的表型和毒力基因表達(dá)差異*

賀 然 王瑞珍 應(yīng) 玥 曲良建 張永安

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 2.北京市植物園 北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心 北京 100093)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)病自1982年在我國首次發(fā)生以來，造成松樹(Pinusspp.)大量死亡，疫情不斷擴(kuò)展蔓延，且近年來有不斷加重流行的趨勢(葉建仁, 2019)。松材線蟲病在亞洲和歐洲造成嚴(yán)重的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)損失，其重要致病因子是全球公認(rèn)的檢疫性有害生物松材線蟲(Futai, 2013; Vicenteetal., 2012; 葉建仁, 2019)。因此，如果不能盡快地有效地防控松材線蟲病疫情，這一重大病害可能很快會在我國更大范圍內(nèi)流行，每年將會引發(fā)數(shù)億株松樹死亡，造成難以管控和治理的生態(tài)災(zāi)難(葉建仁, 2019)。目前我國對松材線蟲的防治手段主要有化學(xué)防治、物理防治、生物防治及綜合防治，但仍以化學(xué)防治為主，如使用化學(xué)藥劑久效磷、甲胺磷、阿維菌素等進(jìn)行點(diǎn)滴注干，雖然可以取得較好的防治效果，但對環(huán)境造成破壞，而且易使線蟲產(chǎn)生抗性(蔡夢玲, 2019)。對松材線蟲直接的大規(guī)模生物防治還沒有典型實(shí)例，因此對松材線蟲開展生物防治急需進(jìn)一步研究和突破(張鍇等, 2010)。

伊氏線蟲真菌(Esteyavermicola，EV)是松材線蟲的內(nèi)寄生真菌，其產(chǎn)生的新月形孢子能夠侵染并穿透線蟲的角質(zhì)層然后在松材線蟲的體腔內(nèi)繁殖，在室內(nèi)純培養(yǎng)條件下，24 h內(nèi)90%的線蟲被EV黏附性的彎月狀孢子侵染，通常8～10天殺死所有的線蟲，從線蟲體內(nèi)長出的菌絲形成彎月狀的孢子進(jìn)入下一個(gè)侵染循環(huán)(Liouetal., 1999; Wangetal., 2008)，在松材線蟲的生物防治方面具有良好的應(yīng)用前景(Liouetal., 1999)。雖然EV在室內(nèi)具有良好的防治松材線蟲的效果，但在野外的防治效果卻不太理想，對感染的松樹需要數(shù)月的時(shí)間才能起到防治效果，而且需要松材線蟲入侵前數(shù)周至數(shù)月提前噴灑或者注射EV(Wangetal., 2017; 2018)。因此，亟需提高EV的生長速率、產(chǎn)孢能力和殺線蟲毒力，才能進(jìn)一步提高EV的防治效果。目前主要通過馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)該真菌，菌株ATCC74485、CBS115803、CNU120806、NKF13222在PDA上生長一周菌落直徑分別為3.0～4.8、3.0～3.7、4.0～4.5和3.1～3.5 cm(茅裕婷等, 2020)。自然界中，線蟲真菌生存環(huán)境可獲得的氮濃度很低，因此，感染線蟲對這類真菌具有顯著益處，可以彌補(bǔ)氮源不足(de Freitas Soaresetal., 2018)。而目前，以氮源為培養(yǎng)基的研究未見報(bào)導(dǎo)。本研究首次以氮源培養(yǎng)EV，以對比在碳氮培養(yǎng)下生長速率的差異，并探究EV在不同培養(yǎng)條件下殺線蟲基因的表達(dá)差異，為明確EV在碳氮培養(yǎng)條件下的表達(dá)模式，提高EV的防治效果和以后大規(guī)模培養(yǎng)高毒力EV提供重要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

伊氏線蟲真菌CBS115803，購于荷蘭菌物保存中心。

1.2 培養(yǎng)基

2種培養(yǎng)基配方如下： 碳源培養(yǎng)基(代號C，6個(gè)重復(fù)樣本分別編號為P1—P6)： 24 g PDB(BD公司)和10 g瓊脂溶于1 L雙蒸水； 氮源培養(yǎng)基(代號N，6個(gè)重復(fù)樣本分別編號為L1—L6)： 5 g酵母粉(OXOID公司)和10 g瓊脂溶于1 L雙蒸水。碳氮混合培養(yǎng)基(C+N，6個(gè)重復(fù)樣本)： 上述2種培養(yǎng)基分別減半溶于1 L雙蒸水中。

1.3 菌落生長、產(chǎn)孢量及菌落生長趨勢圖繪制

測量并記錄3種培養(yǎng)基的菌落直徑，計(jì)算每個(gè)處理的平均菌落直徑和標(biāo)準(zhǔn)差。菌落生長趨勢折線圖由ggplot2-R包繪制。

1.4 轉(zhuǎn)錄組樣品處理

分別將上述2種培養(yǎng)基配制固體C和N培養(yǎng)基，凝固后在培養(yǎng)基中放入已滅菌的尼龍膜(孔徑3 μm，賽多利斯Sartorius)，接種EV菌后于25 ℃培養(yǎng)7天。將長滿菌絲和孢子的尼龍膜用無菌鑷子取出，用超純水沖洗尼龍膜，再用無菌的吸水紙吸掉尼龍膜接觸培養(yǎng)基面的水分，而后將菌絲和孢子刮入2 mL無菌無核酸酶的干燥圓底離心管，迅速將樣品管放入液氮中保存，供RNA提取與測序。

1.5 RNA提取與測序

RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒，按照操作說明書進(jìn)行。通過瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染，使用NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度(OD260/280及OD260/230比值)，使用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性。測序完成后，經(jīng)質(zhì)控過濾獲得clean reads，然后使用HISAT2 v2.0.5將其定位到參考基因組(SRA database in NCBI under the accession SRP097009)(Wangetal., 2018)，基于基因模型注釋文件生成拼接連接的數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)基因組的注釋文件獲得轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果。文庫構(gòu)建與RNA測序由諾禾致源科技股份有限公司采用Illumina測序完成。

1.6 基因表達(dá)水平定量和差異表達(dá)分析

采用當(dāng)前最常用的每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取數(shù)(fragements per kilobase of exon model per million mapped fragements, FPKM)估計(jì)基因的表達(dá)量，獲得各樣本中基因表達(dá)水平。通過計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)評估重復(fù)樣本相關(guān)性。使用DESeq2軟件(1.16.1)進(jìn)行2個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析。結(jié)合經(jīng)FDR法校正后的P值(Padj)以及|log2FoldChange|作為顯著差異表達(dá)判斷的依據(jù)。用H-cluster方法對差異基因表達(dá)量取log2(FPKM+1)并中心化校正后進(jìn)行聚類。差異比較采用C為對照組，N為試驗(yàn)組，將差異表達(dá)基因劃分為上調(diào)基因和下調(diào)基因，即樣品N中的表達(dá)水平高于樣品C中的表達(dá)水平為上調(diào)基因，反之為下調(diào)基因。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

采用在線引物設(shè)計(jì)工具Primer3Plus(http:∥www.primer3plus.com/)設(shè)計(jì)基因特異性引物，采用R2(Fw: TCGTTGAGTAGACTCTGAATGCTG；Rv: AGCCAGATGTTCCACCCG)為內(nèi)參基因(Llanosetal., 2015)。采用TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，北京)試劑盒進(jìn)行DNA清除和反轉(zhuǎn)錄。驗(yàn)證的3個(gè)基因分別為ZGLK4627、novel315、ZGLK4572，所用的引物分別為CGATGCGATTGCCTCCTACT/AGTGCC AGAGATGGTGTTCG、CGCAGGGGAGACAAGATGTT/GGCAAAGCGTTTCTTGTCGT和GGCTGGATGGAGT CGTTTGA/TCGCCGGAGAGAGTGTTTTC。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮培養(yǎng)下的表型

菌落形態(tài)上，N培養(yǎng)基菌落灰白色； C培養(yǎng)基則為暗綠色，菌落邊緣灰白色； C+N培養(yǎng)基白綠色(圖1)。生長速度上，N培養(yǎng)基的生長速度大于C培養(yǎng)基及C+N培養(yǎng)基(圖2)。孢子產(chǎn)量上，N培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小，而且N培養(yǎng)基上不產(chǎn)生桿狀孢子。C+N培養(yǎng)基上彎孢和桿孢均最多(圖3)。

圖1 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)下的EV菌落形態(tài)Fig. 1 Morphology of EV colonies cultured in three mediums 左Left: N; 中Middle: C; 右Right: C+N; 上Up: 正面Front side; 下Down: 背面Back side.

圖2 3種培養(yǎng)基菌落生長趨勢Fig. 2 Growth trajectory on three culture media

圖3 3種培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量Fig. 3 Spore yields on three culture media 誤差線上字母表示差異顯著性，相同字母表示在0.05水平無顯著差異。The letters above the error bars present the significance of the difference and the same letter indicates non-significant at P<0.05.

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、mapping及基因定量分析

為了研究EV在C培養(yǎng)基和N培養(yǎng)基下殺線蟲基因的表達(dá)情況，進(jìn)行了2組轉(zhuǎn)錄表達(dá)的比較研究。每個(gè)樣品產(chǎn)生了超過63 M的clean reads，總堿基數(shù)超過8.9Gb，Q30(堿基識別出錯(cuò)率小于1/1 000)占比超過93%。經(jīng)過與EV基因組比對，97%的片段可定位到基因組上，其中比對到EV基因組唯一位置的片段數(shù)約96%～97%，比對到EV基因組多個(gè)位置的片段低于0.4%。從基因表達(dá)盒形圖可以看出，N培養(yǎng)條件下EV基因表達(dá)水平高于C培養(yǎng)條件下EV基因表達(dá)水平(圖4)。Pearson相關(guān)性分析表明，組內(nèi)相關(guān)性大于0.9，組間相關(guān)性僅為0.5～0.6(圖5)，組間差異大于組內(nèi)差異。

圖4 12個(gè)樣品表達(dá)水平Fig. 4 Expression level box plots of 12 samples

圖5 12個(gè)樣品相關(guān)性系數(shù)Fig. 5 Correlation coefficient graph of 12 samples

2.3 組間差異基因分析

在Padj(FDR)≤0.05且|log2FoldChange|≥0(即差異倍數(shù)≥2)作為顯著差異表達(dá)閾值這一條件下，N組相對C組顯著差異表達(dá)的基因共有7 138個(gè)，其中顯著上調(diào)的3 571個(gè)，顯著下調(diào)的3 567個(gè)(圖6)。在C、N組中共同表達(dá)的核心基因有7 560個(gè)， 在N組中特有表達(dá)的基因474個(gè)，在C組中特有表達(dá)的基因295個(gè)(圖7)，可見，N培養(yǎng)條件下表達(dá)的基因更豐富。在特有表達(dá)的基因中，N組表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子15個(gè)，是C組表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的3倍(5個(gè))。MFS家族、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sugar_tr)和P450等基因在N組也高表達(dá)，在殺線蟲過程中起重要作用的枯草桿菌蛋白酶S8(Peptidase_S8)在N組特異性表達(dá)了3個(gè)，而在C組則沒有特異性表達(dá)。激酶(Pkinase)基因在N組特異性表達(dá)了5個(gè)，在C組則特異表達(dá)了4個(gè)激酶基因(表1)。

圖6 差異基因表達(dá)量變化Fig. 6 Volcano diagram of differential gene

圖7 不同比較組合間差異基因數(shù)量Fig. 7 Venn diagram of differential genes between different comparison groups

經(jīng)過聚類分析，將差異基因表達(dá)水平變化趨勢分為4個(gè)類群，同一類群中的基因在不同的處理?xiàng)l件下具有相似的表達(dá)水平變化趨勢(圖8)。在N組表達(dá)遠(yuǎn)高于C組表達(dá)的基因[log2(FPKM+1)約為6]聚為cluster_1，該組涉及到的基因?yàn)?65個(gè)； 在C組表達(dá)遠(yuǎn)高于N組表達(dá)的基因[log2(FPKM+1)約為5]聚為cluster_2，該組涉及到的基因?yàn)?5個(gè)； 在N組表達(dá)稍高于C組表達(dá)的基因[log2(FPKM+1)約為1]聚為cluster_3； 在C組表達(dá)稍高于N組表達(dá)的基因[log2(FPKM+1)約為1]聚為cluster_4，cluster_3和cluster_4涉及到的基因分別為3 406個(gè)和3 303個(gè)。特別值得關(guān)注的是，在cluster_1中(即N組高表達(dá))有4個(gè)真菌轉(zhuǎn)錄因子(Fungal_trans)、1個(gè)Peptidase_S28、2個(gè)Peptidase_S8； 而在cluster_2(即C組高表達(dá))中，則是無Fungal_trans、Peptidase_S28和Peptidase_S8(表2)。

表1 碳氮組特有表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Tab.1 Specific expression gene statistics between carbon and nitrogen group

表2 圖8中cluster_1和cluster_2表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Tab.2 Specific expression gene statistics between cluster_1 and cluster_2 inFigure 8

圖8 基因表達(dá)水平變化趨勢的聚類Fig. 8 Cluster line chart of the trend of gene expression levels

2.4 致病相關(guān)基因差異表達(dá)

1) 絲氨酸蛋白酶相關(guān)基因： 在致病真菌中，絲氨酸蛋白酶是昆蟲和農(nóng)業(yè)有害線蟲的致病因子(Yangetal., 2007)。特別是枯草桿菌蛋白酶S8(subtilases/peptidase S8)具有致死線蟲的活性，并參與侵染線蟲的過程(Wangetal., 2009； 2007; Yangetal., 2005)，而且枯草桿菌蛋白酶S8在食線蟲真菌基因組中含量豐富(Wangetal., 2018)。為明確在C、N培養(yǎng)條件下EV真菌對線蟲毒力的差異，統(tǒng)計(jì)了屬于絲氨酸家族的peptidase S8、peptidase S28二類基因在組間的變化：共鑒定到顯著上調(diào)(其P值和Padj值均為0)的屬于枯草蛋白酶家族S8基因13個(gè)(表3)。基因長度分布在1 182～3 678 bp之間；分別為相對于C組表達(dá)的2.29～363.52倍，log2FoldChange為1.20～8.51。其中5個(gè)在病原宿主數(shù)據(jù)庫(pathogen host interactions,PHI-base)中注釋到，注釋結(jié)果顯示除一個(gè)基因不影響致病性外，其他4個(gè)基因的突變表型均導(dǎo)致對宿主致病力下降。只有一個(gè)基因(ZGLK1168)顯著下調(diào)，log2FoldChange只有-0.96，下調(diào)的倍數(shù)較小。絲氨酸蛋白酶S28基因只有上調(diào)，上調(diào)的3個(gè)基因log2FoldChange分別為1.84、3.18和6.22，上調(diào)表達(dá)的差異倍數(shù)很大(表3)。

2) 毒素相關(guān)基因： 微生物產(chǎn)生的毒素是導(dǎo)致微生物致病性的重要毒力決定因素(Mohamadzadeh, 2009)。許多植物病原真菌通過分泌毒素殺死宿主細(xì)胞(Ottmannetal., 2009)。同樣的，食線蟲真菌也通過分泌毒素攻擊線蟲(Lpez-Llorcaetal., 2008)。食線蟲真菌的化學(xué)生態(tài)學(xué)還遠(yuǎn)未弄清(Degenkolbetal., 2016a; 2016b)。目前已經(jīng)鑒定到的具有殺線蟲活性的物質(zhì)有oligosporon、4′,5′-dihydrooligosporon、talathermophilins A和B、phomalactone、aurovertins D和F、paeciloxazine、apyridine carboxylic acid derivative和leucinostatins等，但這些殺線蟲物質(zhì)主要是從子囊菌綱中具有捕食結(jié)構(gòu)的食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)及侵染線蟲卵和胞囊的食線蟲真菌中分離到的(Degenkolbetal., 2016a)。關(guān)于線蟲內(nèi)寄生性真菌(Endoparasitic fungi)中殺線蟲毒素的研究極少。內(nèi)寄生真菌EV在不同碳氮培養(yǎng)條件下，毒素合成相關(guān)基因表達(dá)差異顯著，與病原宿主數(shù)據(jù)庫比對，多數(shù)毒素合成相關(guān)基因的突變表型表明，這些基因?qū)儆谥虏』?表4)。

36個(gè)差異表達(dá)毒素相關(guān)基因，共有25個(gè)與毒素相關(guān)的基因上調(diào)，11個(gè)與毒素相關(guān)的基因下調(diào)。差異表達(dá)的16個(gè)T-toxin的調(diào)控合成基因(RTtB)中，13個(gè)基因上調(diào)，3個(gè)基因下調(diào)。2個(gè)AF-toxin合成相關(guān)基因(CaE-EAKt)上調(diào)，3個(gè)AK-toxin合成相關(guān)基因上調(diào)。這些毒素相關(guān)基因最高的上調(diào)132倍，為HC-毒素外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白； 合成AK-toxin必須的ZGLK3633基因上調(diào)22.3倍。PHI數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明，36個(gè)差異表達(dá)基因中的33個(gè)基因可在PHI數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，其中的32個(gè)基因與致病性相關(guān)，其中8個(gè)基因的敲除可直接導(dǎo)致病原菌失去致病力，8個(gè)基因中的6個(gè)均在N組高表達(dá)(表4)。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

選取3個(gè)基因ZGLK4627、novel315、ZGLK4572 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，3個(gè)基因在N組中上調(diào)表達(dá)(圖9)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

3 討論

先前通過不同培養(yǎng)基培養(yǎng)研究真菌的主要方向是研究真菌在不同營養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長特性，如產(chǎn)孢量、菌落特征、生長速度等(Meletiadisetal., 2001)。本研究表明，EV在N培養(yǎng)基中生長速度快，在C+N培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量高。在C+N培養(yǎng)基中生長速度并沒有N培養(yǎng)基中高(觀測時(shí)間內(nèi))，可能原因是C+N混合培養(yǎng)基中，EV首先利用單糖和其他寡糖，然后才利用其他營養(yǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)在氮培養(yǎng)條件下EV基因的整體表達(dá)水平高于碳培養(yǎng)條件，而且氮培養(yǎng)條件下，EV特異表達(dá)的基因多于C組。在氮組中特異表達(dá)的基因中，有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子、降解線蟲體壁的枯草桿菌蛋白酶S8和在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等生命活動中起廣泛作用的激酶基因。

表4 差異表達(dá)毒素相關(guān)基因統(tǒng)計(jì)①Tab.4 Statistics of differential expression of toxin-related genes

圖9 實(shí)時(shí)定量PCR對3條差異表達(dá)基因的驗(yàn)證Fig. 9 Confirmation of the expression profiles of 3 differential expression genes by real-time RT-PCR 誤差線上字母表示差異顯著性，相同字母表示在0.05水平無顯著差異。 The letters above the error bars present the significance of the difference and the same letter indicates non-significant at P<0.05.

真菌的胞外枯草桿菌蛋白酶S8參與真菌的致病性，并在多種昆蟲病原真菌和食線蟲真菌中得到證實(shí)(Bidochkaetal., 2000; Huangetal., 2004; Keniryetal., 2002; Lietal., 2017; Luglietal., 1997; Mortonetal., 2003)。該種蛋白酶最初從昆蟲病原綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) (Legeretal., 1987)和白僵菌(Beauvariabassiana)中分離和鑒定(Bidochkaetal., 1987)。食線蟲真菌產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶能降解線蟲角質(zhì)中的蛋白及卵殼中的蛋白，在侵染線蟲過程發(fā)揮重要作用(Mortonetal., 2004)。該蛋白酶可從少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)(Wangetal., 2006)和厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia) (Segersetal., 1994)等食線蟲真菌中分別純化和鑒定。EV真菌在氮培養(yǎng)條件下Peptidase_S8家族中的多個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，最高的表達(dá)差異倍數(shù)大于60倍。因此可以推測氮培養(yǎng)條件有利于殺線蟲基因的表達(dá)。

許多微生物會產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，進(jìn)而從營養(yǎng)來源中排除競爭性微生物。寄生的昆蟲病原真菌和食線蟲真菌通過毒素使宿主失去活力來促進(jìn)感染(Mortonetal., 2004)。昆蟲病原真菌綠僵菌產(chǎn)生一種稱為destruxins的毒素，可以殺死昆蟲，并且destruxin的產(chǎn)生與致病性相關(guān)(Kershawetal., 1999)。食線蟲真菌也可產(chǎn)生毒素(Morgan-Jonesetal., 1985)。培養(yǎng)基、pH值等試驗(yàn)條件會影響殺線蟲真菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如不同的pH值和培養(yǎng)基導(dǎo)致厚垣孢普可尼亞菌殺線蟲代謝物的差異;Khambay等(2000)進(jìn)一步從該菌中分離到一種殺線蟲代謝產(chǎn)物phomalactone，該毒素在侵染線蟲幼蟲的過程中發(fā)揮作用。食線蟲真菌EV在氮培養(yǎng)條件下，大量的毒素合成基因或毒素調(diào)控基因高表達(dá)，該培養(yǎng)條件很可能會產(chǎn)生大量的毒素，但需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。EV真菌的殺線蟲毒素有待進(jìn)一步開發(fā)?；贓V不同培養(yǎng)條件下的表型數(shù)據(jù)及固有的EV高碳培養(yǎng)方式，建議培養(yǎng)時(shí)加入一定量的氮源，從而提高孢子產(chǎn)量。根據(jù)轉(zhuǎn)錄差異分析結(jié)果，N培養(yǎng)條件下可提高殺線蟲基因和毒素產(chǎn)生基因的表達(dá)，或許可以縮短侵染松材線蟲的時(shí)間，這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

松材線蟲生防真菌EV在N培養(yǎng)基下生長速度快，在C+N培養(yǎng)基中2種孢子的產(chǎn)量高。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了C、N培養(yǎng)基下差異表達(dá)基因和特異表達(dá)基因。氮培養(yǎng)條件下的EV真菌表達(dá)的總基因數(shù)量和特異表達(dá)的基因數(shù)量高于碳培養(yǎng)條件下的基因表達(dá)。具有殺線蟲作用的枯草桿菌蛋白酶、毒素合成等相關(guān)基因在氮培養(yǎng)下顯著上調(diào)。研究結(jié)果可為高毒力EV菌株的培養(yǎng)和提高EV生防真菌的防治效果提供重要理論基礎(chǔ)。