王曉國，李秀玲，董 艷，周主貴*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】兜蘭屬是蘭科植物中最具特色的一個類群，廣布于東南亞、南洋群島及太平洋西南大洋洲島嶼國家[1-3]。我國西南地區(qū)及華南部分地區(qū)是兜蘭主要分布區(qū)之一[4-5]，近年來其生境已遭受嚴重破壞，極大地影響帶葉兜蘭的種群恢復和擴展[6]。土壤真菌可通過多種方式進入蘭科植物根系，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在一定程度上會影響蘭科植物根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)。至今關于蘭科植物中根區(qū)土壤和根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)的相關性仍不明確[7]。因此，分析帶葉兜蘭根內(nèi)和根區(qū)土壤真菌群落組成及其相關關系，對帶葉兜蘭的保育和種群恢復具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】土壤中的部分真菌可與蘭科植物根形成菌根以維持互利共生關系，土壤中菌根真菌的豐度越大，與生長在該地的蘭科植物形成共生關系的菌根真菌越多，就越有利于蘭科植物生長[8]。McCormick等[9]發(fā)現(xiàn)，有地生蘭種子萌發(fā)的地方，其特異共生真菌豐度一般較高，且越靠近成熟蘭科植物則真菌的豐度就越高。根系中發(fā)現(xiàn)的部分菌根真菌在土壤中也有廣泛分布[10-11]，對土壤中菌根真菌進行檢測，可判斷該地點是否適合相應蘭科植物生長[11]。但蘭科植物根內(nèi)的菌根真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤中的菌根真菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同，菌根真菌在根內(nèi)的豐度最大，根內(nèi)的菌根真菌中只有少數(shù)在土壤中出現(xiàn)[12-13]，蘭科植物根內(nèi)的真菌群落與土壤的真菌群落在一定程度上相互獨立[14]，菌根真菌在土壤中的分布與蘭科植物無明顯關系[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對廣西帶葉兜蘭分布區(qū)內(nèi)兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤真菌群落組成的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】對帶葉兜蘭根內(nèi)和根區(qū)土壤的真菌群落組成進行初步分析，探究帶葉兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的差異，為深入研究蘭科植物菌根與土壤環(huán)境的關系及帶葉兜蘭的保育和種群恢復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品2018年12月采自廣西農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所蘭科植物資源圃中收集的野生兜蘭材料，共取5盆帶葉兜蘭根樣品和土壤樣品，根樣品標記為P01、P02、P03、P04和P05，根區(qū)土壤樣品標記為S01、S02、S03、S04和S05。每盆收集5條長約5.0 cm的根段和盆內(nèi)5.0～15.0 cm土層的土壤，根段和土壤分別混合為一個處理。樣品收集后迅速帶回實驗室用液氮速凍并置于-80 ℃冰箱短期保存后用于提取總DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 帶葉兜蘭根系和根區(qū)土壤總DNA提取 參照王曉國等[20]的方法進行根系表面處理。根段表面消毒后，參照植物DNA提取試劑盒說明提取根樣品的總DNA，參照土壤DNA提取試劑盒說明提取根區(qū)土壤總DNA。所提取DNA的完整性以1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，同時采用Nanodrop紫外分光光度計(USA)對DNA進行定量。

1.2.2 樣品真菌基因組ITS擴增及測序 以50.0～100.0 ng DNA為模板，PCR擴增跨越真菌18S rDNA高變區(qū)V3和V4區(qū)域的500堿基，采用包含5′-GGCAAGTCTGGTGCC-3′序列的上游引物和包含5′-ACGGTATCTRATCRTC-3′序列的下游引物擴增部分V3區(qū)和全長V4區(qū)；采用包含5′-CGWTAACGAACGAG-3′序列的上游引物和包含5′-AICCATTCAATCGG-3′序列的下游引物擴增全長V7和V8區(qū)；通過PCR向18S rDNA的PCR產(chǎn)物末端加上帶有Index的接頭，以便進行NGS測序。擴增體系25.0 μl：5.0 μl 5×reaction Buffer，5.0 μl 5×GC Buffer，2.0 μl dNTP(2.5 mmol/L)，1.0 μl上游引物(10.0 μmol/L)，1.0 μl下游引物(10.0 μmol/L)，2.0 μl DNA模板，8.75 μl ddH2O，0.25 μl Q5 DNA Polymerase。擴增程序：98 ℃ 2.0 min；98 ℃ 15.0 s，55 ℃ 30.0 s，進行25～27個循環(huán)；72 ℃ 30.0 s，72 ℃ 5.0 min，最后于10 ℃保溫。PCR擴增產(chǎn)物通過2 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測與純化，并采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對目標片段進行切膠回收。將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量(熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader(FLx800、BioTek和Vermont，USA))。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣品的測序量需求，對各樣品按相應比例進行混合。

DNA文庫混合后，按Illumina MiSeq(Illumina、San Diego和CA，USA)儀器使用說明進行2×300/250雙端測序(PE)，通過MiSeq工具中的MiSeq control software(MCS)進行圖像分析和堿基識別，最后在Illumina basespace云端計算平臺進行初始分類分析。

1.2.3 序列分析、OUT分類及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用QIIME軟件通過USEARCH(v5.2.236)檢查并剔除嵌合體序列，得到主要分布在200～300 bp長度的序列用于OTU分析。將豐度值低于全體樣品測序總量0.001 %的OTUs去除，使用VSEARCH1.9.6進行序列聚類(序列相似性設為97 %)，比對的ITS rRNA參考數(shù)據(jù)庫為UNITE ITS database(https://unite.ut.ee/)。然后用RDP classifier貝葉斯算法對OTUs的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣品的真菌群落組成?；贠TU分析結(jié)果，采用對樣品序列進行隨機抽樣的方法分別計算Shannon和Chao1等α多樣性指數(shù)，并繪制稀釋曲線。通過Unweighted unifrac分析比較樣品間的微生物群落是否存在顯著差異，基于Unweighted unifrac樣品間距離矩陣用于PCoA(principal co-ordinates analysis)可視化圖展示β多樣性。通過層次聚類(Hierarchical cluatering)中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

表1 各樣品真菌的測序數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 帶葉兜蘭各樣品真菌的OUT水平分析

對帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌進行測序，樣品最短平均長度為362 bp，最長平均長度為413 bp，共測得原始序列751 282條(其中根樣品492 507條，根區(qū)土壤樣品258 775條)，過濾去掉低質(zhì)量序列并均一化后，獲得有效序列310 660條，在97 %相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，統(tǒng)計得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息284個(表1)。其中根樣品P05的OTUs數(shù)最多，土壤樣品S05的OTUs數(shù)最少。

從圖1可看出，帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的稀釋曲線基本趨于平緩，說明這些樣品中基本覆蓋了絕大多數(shù)真菌，其真菌群落具有多樣性，所測得的序列基本可反映真實環(huán)境中的真菌群落結(jié)構(gòu)。但稀釋曲線未達到完全飽和，仍有部分真菌種類未被發(fā)現(xiàn)。

2.2 各帶葉兜蘭樣品中真菌群落的關聯(lián)性分析

從OUTs分布來看，所有根樣品的OTUs有216個，特有的OTUs有57個；所有根區(qū)土壤樣品的OUTs有229個，特有的OTUs有70個；根樣品和根區(qū)土壤樣品共有的OTUs有159個(圖2-A)；在所有樣品中，S04的OTUs數(shù)最多，有19個，其次是S01，有15個，P01、P04、S03和S05的OTUs數(shù)最少，均為1個；所有樣品共有的OUTs有3個，分別為OTU133、OUT56和OTU225(圖2-B)。說明帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落組成在個體間存在一定差異。從屬的分布來看，根樣品共有96個屬，12個特有屬；根區(qū)土壤樣品共有96個屬，12個特有屬；根樣品和根區(qū)土壤樣品共有屬為84個(圖2-C)；在所有樣品中，P03和S04各有2個特有屬，而P01、P04、S02和S05沒有特有屬；所有樣品共有屬為5個，分別為籃狀菌屬(Talaromyces)、盤菌屬(Leotiomycetes)、鐮刀菌屬(Fusarium)、Boeremia和Heteromita(圖2-D)。綜上所述，帶葉兜蘭的根內(nèi)真菌群落組成與根區(qū)土壤有一定程度的相似性，但群落組成隨著植株個體不同存在差異。

2.3 各帶葉兜蘭樣品真菌群落的多樣性及結(jié)構(gòu)差異分析

不同樣品間的Shannon指數(shù)存在一定差異，但總體上趨于一致，說明帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落分化程度較低(表2)；從群落豐度Chao 1指數(shù)來看，根區(qū)土壤樣品低于根樣品，說明帶葉兜蘭根內(nèi)的真菌群落分化程度較高。

表2 各樣品真菌群落的Alpha多樣性分析結(jié)果

主成分(PCA)分析結(jié)果表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對樣品真菌群落組成差異性的貢獻率分別為63.33 %和12.11 %，合計達75.44 %，是差異的主要來源(圖3)。根區(qū)土壤樣品較集中分布在一個區(qū)域，距離較近，表明根區(qū)土壤樣品間的真菌群落組成差異較??；而根樣品分布較分散，距離較遠。說明帶葉兜蘭根區(qū)土壤樣品間的真菌群落組成差異較小，根樣品間雖有相似的真菌群落組成，但仍存在較大差異，可能與植株個體間存在差異有關。

2.4 各帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品間的真菌群落結(jié)構(gòu)組成

對各帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的OTUs依次在門(Phylum)、綱(Class)、目(Order )、科 ( Family )和屬(Genus)水平上的信息進行分析，結(jié)果(表3)表明，帶葉兜蘭真菌群落共涉及25門48綱81目96科107屬141種及大量未分類種。其中，根樣品中P05的真菌種類最多，有95種，P01的真菌種類最少，僅59種；根區(qū)土壤樣品中S01的真菌種類最多，有102種，S05的真菌種類最少，僅21種。

在科水平上對32科[包括叢赤殼科(Nectriaceae)、蟲草科(Cordycipitaceae)、小皰毛殼科(Herpotrichiellaceae)、小雙腔菌科(Didymellaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、發(fā)菌科(Trichocomaceae)、扁孔腔菌科(Ophiostomataceae)、圓盤菌科(Orbiliaceae)、Trichomeriaceae、Mytilinidaceae及一些未知類群]進行群落分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，根樣品中P03涉及的科最多，有16科，P04涉及的科最少，僅8科；根區(qū)土壤樣品中S01涉及的科最多，有27科，S05涉及的科最少，僅5科(圖4-A)。其中，根樣品中的叢赤殼科、蟲草科、norank_o_Liliopsida和unclassified_c_Embryophyta為優(yōu)勢菌群，約占根樣品中總科數(shù)的80 %，而根區(qū)土壤樣品中的叢赤殼科、蟲草科、norank_p_Mucoromycota和unclassified_c_Thecofilosea為優(yōu)勢菌群，約占土壤樣品中總科數(shù)的75 %(圖4-B)；叢赤殼科和蟲草科同為根樣品及根區(qū)土壤樣品的優(yōu)勢菌群，說明根樣品和根區(qū)土壤樣品的部分優(yōu)勢菌群差異影響了真菌群落的組成。此外，在根樣品和根區(qū)土壤樣品中還存在大量未分類菌群，占比分別達5 %和10 %左右。

基于種分類水平，5個根樣品和5個根區(qū)土壤樣品可分為3大分支，根樣品與根區(qū)土壤品樣無單獨聚在一起的分支(圖5)。其中，根區(qū)土壤樣品中的S04單獨聚為1個分支，其物種種類和豐度與其他樣品間差異最明顯；根樣品中P03、P04和P05聚為1個分支，其物種種類和豐度較相似；根樣品中P01和P02在第三大分支上聚為1個小枝，其物種種類和豐度相似，根區(qū)土壤樣品中S01和S03在第三大分支上聚為1個小枝，其物種種類和豐度相似，根區(qū)土壤樣品中S02和S05在第三大分支上各聚為1個小枝，其物種種類和豐度與其他小枝存在一定差異。說明根樣品和根區(qū)土壤樣品在種類和豐度方面存在一定差異，但總體上趨于一致。

在屬水平上，共有15屬真菌的相對豐度存在差異，其中鐮刀菌屬(Fusarium)和蟲草屬(Cordycipitaceae)在根樣品和根區(qū)土壤樣品中的相對豐度較接近，分布較均衡，肉環(huán)菌屬(Sarcosomataceae)、Embryophyta、Liliopsida、Mucoromycota和Alloteropsis5屬的真菌在根樣品和根區(qū)土壤樣品真菌的相對豐度存在顯著差異(圖6,P<0.05)。此外，Embryophyta和Liliopsida真菌僅在根樣品中檢測到，肉環(huán)菌屬、Mucoromycota和Alloteropsis真菌僅在根區(qū)土壤樣品中檢測到，屬于根樣品或根區(qū)土壤樣品中的特異真菌。說明根樣品和根區(qū)土壤樣品中僅有少部分真菌種類和相對豐度存在差異，多數(shù)真菌的相對豐度總體上差異較小。

3 討 論

本研究對帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落進行分析，發(fā)現(xiàn)在帶葉兜蘭根樣品中大部分真菌屬于非菌根真菌，菌根真菌僅占極少部分，可能與帶葉兜蘭是遷地保存材料，其生長的環(huán)境、氣候發(fā)生改變和人為的管理造成在適應環(huán)境過程中菌根真菌群落發(fā)生了較大變化有關。前人研究發(fā)現(xiàn)，蘭科菌根(OM)真菌群落結(jié)構(gòu)受多種因素影響，植被、海拔、土壤物理性質(zhì)如濕度、類型、有機質(zhì)成分和pH等均能影響OM真菌群落組成[15-19]；生境變化也會影響OM真菌群落結(jié)構(gòu)，以光和自養(yǎng)型地生蘭菌根為例，有些真菌種類存在于干燥環(huán)境而其他真菌僅在非本地種植園內(nèi)存在[20]。此外，鐮刀菌是一種蘭科植物根中常見的非菌根真菌，但能有效促進蘭科植物種子萌發(fā)和生長[15，21-22]；采用傳統(tǒng)方法分離獲得的帶葉兜蘭菌根真菌中，鐮刀菌為優(yōu)勢菌群，可能是由于生境改變，使得帶葉兜蘭從非菌根真菌中獲取養(yǎng)分的機率增大，從而減少對菌根真菌的依賴。

表3 帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落分類學統(tǒng)計結(jié)果

本研究從帶葉兜蘭根樣品中測得600條OTUs，從根區(qū)土壤樣品中測得587條OTUs，說明蘭科植物根的真菌種類和數(shù)量與根區(qū)土壤接近，即根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌組成趨于一致，PCA和UPGMA聚類分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)帶葉兜蘭根樣品的真菌群落與根區(qū)土壤樣品的真菌群落在組成和結(jié)構(gòu)上雖然存在一定差異但差異程度較小，其中Nectriaceae和Cordycipitaceae同為根樣品和根區(qū)土壤樣品的優(yōu)勢菌群，而根樣品與根區(qū)土壤樣品的優(yōu)勢真菌組成具有較高相似度，表明蘭科植物根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌群落在組成方面存在明顯的相關關系。但也有研究認為蘭科植物的真菌群落與土壤的真菌群落在一定程度上相互獨立[11，16]。這可能與樣品的土壤環(huán)境關聯(lián)性較大。本研究所用帶葉兜蘭材料為遷地保護材料，生長環(huán)境和土壤條件與其原生生境差異較大導致蘭科植物根內(nèi)真菌群落與根區(qū)土壤真菌群落的關聯(lián)性與前人研究結(jié)果不同。然而，目前對蘭科植物菌根真菌在土壤中的動態(tài)分布僅局限于了解到根中發(fā)現(xiàn)的大部分菌根真菌在土壤中廣泛分布[9-14]。

土壤中潛在的蘭科菌根真菌也存在蘭科植物根中，但二者菌根真菌的相對豐度不同[23]；與蘭科植物相關的某些菌根真菌群落在土壤中未被發(fā)現(xiàn)[7，24]。本研究通過分子手段，對帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品真菌群落進行初步分析，發(fā)現(xiàn)根區(qū)土壤中潛在的非蘭科菌根真菌鐮刀菌為優(yōu)勢菌群，而鑒于目前關于帶葉兜蘭根區(qū)土壤潛在非蘭科菌根真菌的研究鮮見報道，本研究認為帶葉兜蘭根區(qū)土壤真菌群落組成可在一定程度上反映其根內(nèi)的真菌群落組成。

4 結(jié) 論

帶葉兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌群落具有相似結(jié)構(gòu)，種類間和豐度間差異不明顯，但根內(nèi)與根區(qū)土壤共有多數(shù)種類的優(yōu)勢菌群。