李國澤，邵亞林，常 瑋，丁 勇*

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204)

【研究意義】兜蘭屬(Paphiopedilum)植物花形奇特，色彩鮮艷，花期長，是極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的蘭科(Orchidaceae)植物之一。但正因其具有奇特性、巨大的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值等，人為遭到了掠奪性采挖而造成野生資源及其生境破壞嚴(yán)重[1]，再加上受分布區(qū)域的限制以及兜蘭萎蔫病害頻發(fā)等自然因素的影響[2]，很大程度上阻礙了兜蘭屬植物的可持續(xù)發(fā)展。隨著兜蘭同科不同屬如蘭屬(Cymbidium)、蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、文心蘭屬(Oncidium)等觀賞性蘭花在分子方面取得的研究進(jìn)展[3]，充分利用兜蘭屬植物獨(dú)特的生態(tài)、資源以及遺傳多樣性等優(yōu)勢(shì)，從分子生物學(xué)角度出發(fā)開展兜蘭屬植物分子生物學(xué)方面的研究，為兜蘭屬植物在種質(zhì)資源保護(hù)及新品種的開發(fā)利用提供了新的思路。【前人研究進(jìn)展】兜蘭因其半橢圓形唇瓣高度特化成兜狀故名“兜蘭”，一般生長于疏灌叢中或林緣，性喜濕潤而溫暖的環(huán)境。兜蘭屬植物全球大約有80多個(gè)種，分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國有18種，主產(chǎn)西南各省區(qū)，華南亦有少量種類分布，其中云南地區(qū)分布較多，有14種(占全國的77.8 %，世界的21.5 %)[4]。面對(duì)兜蘭屬植物面臨的生境破壞以及人為采集等因素帶來的壓力，羅毅波等[1]在兜蘭保護(hù)生物學(xué)方面的研究中指出，原地保護(hù)、種子繁殖、適時(shí)的遷地保護(hù)、制定有效的保護(hù)策略及措施等對(duì)兜蘭屬植物野生資源的保護(hù)是必要的。同樣，利用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行大規(guī)?？寺》敝常嗫梢詼p輕對(duì)野生兜蘭植物的采集壓力。兜蘭屬植物離體快繁研究主要集中在兩個(gè)方面：一是原生種的無菌播種；二是利用試管內(nèi)由種子萌發(fā)而來的原球莖或小苗進(jìn)行組織培養(yǎng)[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，加快兜蘭屬植物分子生物學(xué)方面的研究，可以為兜蘭屬植物在生長發(fā)育、代謝調(diào)控機(jī)制以及種質(zhì)資源的開發(fā)、利用與保護(hù)等多個(gè)方面提供基本的分子生物學(xué)理論依據(jù)。開展兜蘭組織RNA的提取是深入兜蘭分子生物學(xué)方面研究的必要前提。而兜蘭屬植物多數(shù)葉片革質(zhì)化、肉質(zhì)化，且富含酚類、多糖等次生代謝產(chǎn)物，其核酸提取困難[6]，對(duì)兜蘭屬植物開展分子遺傳學(xué)以及相關(guān)功能基因的研究等產(chǎn)生一定阻礙。因此尋找適合兜蘭植物高質(zhì)量總RNA提取的方法是分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵。【本研究切入點(diǎn)】以紫紋兜蘭(Paphiopedilumpurpuratum)、長瓣兜蘭(Paphiopedilumdianthum)和杏黃兜蘭(Paphiopedilumarmeniacum)為試驗(yàn)材料，以RNA試劑盒法、改良CTAB法和2種改良Trizol法(Ⅰ和Ⅱ)提取兜蘭植物葉片總RNA并進(jìn)行效果比較?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選適合3種兜蘭屬植物葉片高質(zhì)量總RNA的提取方法，為開展兜蘭屬植物后續(xù)分子生物學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為培養(yǎng)于科研基地溫室大棚內(nèi)的長瓣兜蘭、紫紋兜蘭和杏黃兜蘭3種兜蘭屬植物，成熟健康葉片用蒸餾水清洗表面污物、脫脂棉吸干水分后取樣，按樣品0.1 g試驗(yàn)要求稱取后置于液氮中速凍，后保存至-80 ℃冰箱中備用。

1.2 總RNA提取方法

以下各方法中，液氮研磨樣品量為0.1 g，最后總RNA用40 μl DEPC處理水溶解，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)重復(fù)3次。

1.2.1 RNA試劑盒法 按照康為世紀(jì)全能型植物RNA提取試劑盒(DNase I)說明書操作步驟進(jìn)行總RNA提取。

1.2.2 改良CTAB法 參考容天聚等[7]的方法并做改良，具體調(diào)整為在步驟(2)的基礎(chǔ)上重復(fù)使用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次；在步驟(4)的基礎(chǔ)上2次使用提前預(yù)冷的75 %乙醇進(jìn)行RNA洗滌。其他步驟均相同。

1.2.3 改良Trizol法(Ⅰ) 在孫國勝等[8]方法步驟的基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)：①取容積為2 mL的離心管，先后加入液氮研磨的植物樣品粉末和Trizol試劑1 mL，立即使用旋渦震蕩儀劇烈振蕩混勻，室溫放置5 min，使其充分裂解；②4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于另一容積為2 mL的離心管中，加入氯仿200 μl，振蕩混勻，室溫放置15 min；③4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上層水相至另一容積為1.5 mL的離心管中，加入異丙醇500 μl，振蕩混勻，室溫放置15～30 min。④4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，RNA沉于管底，加入75%乙醇1 mL，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；⑤4 ℃ 8000 r·min-1離心10 min，盡量棄上清液；⑥將離心管在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干5 min獲得總RNA。

1.2.4 改良Trizol法(Ⅱ) 在1.2.3的基礎(chǔ)上調(diào)整為改良Trizol法(Ⅱ)提取總RNA：在步驟①裂解離心管中增加β-巰基乙醇20 μl；在步驟②的基礎(chǔ)上重復(fù)使用氯仿抽提2次，并縮短室溫放置時(shí)間至5 min；在步驟③的基礎(chǔ)上改變RNA沉淀的環(huán)境，為-20 ℃放置10 min；在步驟④的基礎(chǔ)上2次使用75 %乙醇進(jìn)行RNA洗滌。

1.3 總RNA質(zhì)量檢測

樣品總RNA先用電泳儀(DYY-8C)電泳檢測(1.0 %的瓊脂糖凝膠，上樣量2.5 μl)，然后通過凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)觀察其完整性；樣品總RNA濃度和吸光度A260/A280比值采用超微量核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop 2000)測定。使用SPSS 23.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 RT-PCR檢測分析

以綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)的改良Trizol法(Ⅱ)提取的3種兜蘭總RNA為模板，按康為世紀(jì)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)制備成第一鏈cDNA。從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找獲得3種兜蘭屬植物的1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbcL)序列(GenBank：紫紋兜蘭MK161066.1、長瓣兜蘭MF983795.1、杏黃兜蘭LC085347.1)，在3個(gè)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)共用特異性引物(F：5′-CACATCGAAGCCGTTGTTGG-3′、R：5′-TAGGGGACGACCGTACTTGT-3′，預(yù)期產(chǎn)物均為252 bp)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μl：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl，cDNA模板2.0 μl，引物F、R各1.0 μl，ddH2O 8.5 μl。擴(kuò)增程序中，預(yù)變性為94 ℃、5 min；然后經(jīng)94 ℃ 30 s變性、55 ℃ 30 s退火和72 ℃ 1 min延伸程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；之后72 ℃延伸10 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測為特異性的PCR產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，以進(jìn)一步檢測總RNA質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA完整性分析

采用不同方法提取獲得的紫紋兜蘭總RNA經(jīng)電泳檢測結(jié)果如圖1所示，RNA試劑盒法提取的總RNA 5.8 S rRNA條帶未顯示，28 S和18 S rRNA條帶雖較完整但較暗，說明該方法提取的總RNA完整性一般、濃度較低。其他3種方法提取的總RNA均顯示28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶，改良CTAB法獲得的總RNA存在較明顯的降解現(xiàn)象，完整性差；改良Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)提取的總RNA條帶清晰，完整性好；條帶亮度的差異表明總RNA濃度各異，改良Trizol法(Ⅱ)的最高，并依次高于改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)。

長瓣兜蘭總RNA凝膠電泳結(jié)果(圖2)顯示，4種不同提取方法中，RNA試劑盒法提取的總RNA只可見2條帶(28 S和18 S rRNA)、且亮度較弱，表明其完整性一般，濃度較低。改良CTAB法提取的總RNA雖可見28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶，但存在明顯降解現(xiàn)象，表明完整性差。改良Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)獲得的總RNA均清晰可見28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶、無降解，表明完整性均好；改良Trizol法(Ⅱ)的條帶亮度明顯強(qiáng)于改良Trizol法(Ⅰ)，說明前者的總RNA濃度高于后者。

杏黃兜蘭總RNA電泳檢測結(jié)果如圖3所示，改良CTAB法提取的總RNA可見28 S、18 S和5.8 S rRNA條帶，亮度最強(qiáng)，但降解現(xiàn)象較明顯，表明其完整性差。其他3種方法提取的總RNA條帶亮度均較弱，說明濃度均較低；改良Trizol法(Ⅰ)和(Ⅱ)提取的總RNA顯示完整的rRNA 3條帶，而RNA試劑盒法提取的總RNA只可見rRNA 2條帶，表明改良Trizol法(Ⅰ)和(Ⅱ)提取的總RNA完整性好，RNA試劑盒法提取的總RNA完整性一般。

2.2 總RNA純度分析

通常，較為理想總RNA A260/A280的比值應(yīng)介于1.8 ～ 2.1，低于1.7則表明會(huì)有蛋白或其他有機(jī)物污染，高于2.2則表明RNA被水解或污染。從表1可以看出，RNA試劑盒法、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅱ)獲得的紫紋兜蘭總RNA A260/A280的比值分別為2.18、1.81和1.86，表明其總RNA純度均較高。而改良Trizol法(Ⅰ)提取的紫紋兜蘭總RNA A260/A280的比值則為1.65，表明其純度低，存在一定的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染。

表1 4種不同提取方法獲得的3種兜蘭植物葉片總RNA的純度分析

RNA試劑盒法、改良Trizol法(Ⅱ)、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)提取長瓣兜蘭總RNA A260/A280的比值(表1)分別為2.11、1.96、1.86和1.54，表明前3種方法提取的總RNA純度高、無雜質(zhì)污染，后一種方法提取的總RNA純度低、雜質(zhì)污染嚴(yán)重。這與4種不同方法提取紫紋兜蘭總RNA的純度結(jié)果相一致。

杏黃兜蘭總RNA純度檢測結(jié)果中(表1)，RNA試劑盒法和改良Trizol法(Ⅱ)提取總RNA A260/A280的比值分別為2.10和1.79，表明總RNA純度均較高、無雜質(zhì)污染，但前者純度優(yōu)于后者；改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)提取的總RNA A260/A280的比值分別為1.44和1.51，表明此2種提取方法所獲得的總RNA均存在嚴(yán)重的污染、純度較低。

2.3 總RNA提取效率和得率分析

由表2顯示，采用4種不同提取方法獲得的紫紋兜蘭、長瓣兜蘭和杏黃兜蘭3種兜蘭屬植物總RNA的提取時(shí)間、得率及濃度均存在一定差異?？俁NA提取時(shí)間RNA試劑盒法最短，為1.0 h；改良Trizol法(Ⅱ)和(Ⅰ)次之，分別為1.5和2.0 h；改良CTAB法最長，約為17.0 h。

紫紋兜蘭總RNA提取得率，改良Trizol法(Ⅱ)最高，為75.93 μg·g-1，顯著高于改良CTAB法(38.28 μg·g-1)、改良Trizol法(Ⅰ) (31.49 μg·g-1)和RNA試劑盒法(18.65 μg·g-1)3種方法；4種方法提取的總RNA濃度與圖1顯示的總RNA亮度相吻合。長瓣兜蘭總RNA提取得率，改良Trizol法(Ⅱ)、改良CTAB法和改良Trizol法(Ⅰ)分別為65.35、46.01和36.40 μg·g-1，提取得率RNA試劑盒法顯著低于其他3種方法(P<0.05)，僅為18.77 μg·g-1，與圖2顯示的凝膠電泳圖像相一致。杏黃兜蘭RNA，改良CTAB法最高，為42.55 μg·g-1；改良Trizol法(Ⅱ)、改良Trizol法(Ⅰ)和RNA試劑盒法分別為26.53、25.31和18.44 μg·g-1，均顯著低于改良CTAB法，與總RNA顯示的條帶(圖3)亮度差異相一致。

2.4 兜蘭屬植物總RNA提取效果評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)采用4種方法分別提取3種兜蘭總RNA的效果，紫紋兜蘭和長瓣兜蘭的提取效果均顯示改良Trizol法(Ⅱ)獲得的總RNA完整性、純度和濃度均較好；杏黃兜蘭的提取效果以改良Trizol法(Ⅱ)獲得的總RNA完整性和純度較好，但濃度偏低，雖CTAB法獲得的濃度最高，但完整性和純度很差。針對(duì)改良Trizol法(Ⅱ)提取杏黃兜蘭總RNA濃度低的問題，可以通過增加原始材料用量和純化濃縮提高總RNA量獲得。從總RNA提取的完整性、純度、濃度以及提取時(shí)間的綜合結(jié)果表明，改良Trizol法(Ⅱ)是適合3種兜蘭屬植物高質(zhì)量總RNA提取的有效方法。

表2 4種提取方法獲得的3種兜蘭植物葉片總RNA的效率和得率分析

2.5 RT-PCR分析

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳(圖4)顯示，從改良Trizol法(Ⅱ)提取的3種兜蘭植物總RNA中均獲得與預(yù)期長度相符的、清晰明亮的特異性單一條帶，經(jīng)測序分析與3種兜蘭已知目的基因rbcL的252 bp序列完全一致。該結(jié)果進(jìn)一步表明，改良Trizol法(Ⅱ)能從3種兜蘭植物中提取高質(zhì)量總RNA，并能滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)要求。

3 討 論

分子生物學(xué)研究的前提是高質(zhì)量核酸的獲取，針對(duì)不同植物材料或不同組織，尋找適合特定植物核酸提取的方法顯得尤為重要，目前，植物總RNA提取常用的方法有RNA試劑盒法、CTAB法和Trizol法等。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用RNA試劑盒法提取植物總RNA的研究越來越多，RNA試劑盒法具有操作方便，省時(shí)省力等優(yōu)勢(shì)。目前已經(jīng)從核桃(Juglansregia)[9]、冬凌草(Isodonrubescens)[10]、象草(Pennisetumpurpureum)[11]和云南蘿芙木(Ravolfiayunnanenisis)[12]等植物中分離出較高質(zhì)量的RNA。但由于不同植物組織或器官對(duì)應(yīng)的細(xì)胞成分往往存在很大差異，對(duì)RNA提取要求也不一樣。研究應(yīng)用RNA試劑盒法提取的3種兜蘭總RNA純度均較好，但完整性較差，且獲得的RNA濃度低，效果一般。推測RNA試劑盒中的提取液對(duì)3種兜蘭組織的裂解不夠徹底，而且RNA試劑盒法需要吸附柱多次過濾和洗滌，造成總RNA得率降低，影響總RNA質(zhì)量。

CTAB法因避免使用有毒而昂貴的苯酚、異硫氰酸胍和鹽酸胍等試劑而被廣泛應(yīng)用于多種植物總RNA的提取。應(yīng)用該方法已獲得松(Pinus)[13]、橄欖(Canariumalbum)[14]、棗(Ziziphusjujuba)的芽和幼葉[15]等植物較理想的總RNA。但是傳統(tǒng)的CTAB法在應(yīng)用于不同植物組織RNA提取時(shí)，可能無法獲得較高質(zhì)量的RNA[15-18]。因此，在科學(xué)研究中通常需要對(duì)CTAB法進(jìn)行改良優(yōu)化，常見的改良方式有：提取過程中加入β-巰基乙醇、增大提取液濃度和改變沉淀劑[16,19]等。如關(guān)玲等[17]通過改進(jìn)各組分的用量(提取液PVP和CTAB的用量)和濃度(β-巰基乙醇的濃度和NaAc濃度)獲得了草莓(Fragariaananassa)、葡萄(Vitisvinifera)和蘋果(Malusdomestica)等不同類型植物理想的RNA；石樂松等[19]發(fā)現(xiàn)，CTAB法結(jié)合LiCl沉淀純化DNA是一種高效提取文心蘭(Oncidiumhybridum)RNA的方法；仇碩等[18]同樣通過改良的CTAB法獲得了5種石斛屬(Dendrobium)植物成熟葉片較高純度總RNA。從獲得的3種兜蘭總RNA提取效果來看，應(yīng)用CTAB法時(shí)，除采用上述改良優(yōu)化策略外，還在提取過程中增加氯仿-異戊醇抽提次數(shù)和使用75 %乙醇提前預(yù)冷2個(gè)步驟。3種兜蘭均存在不同程度的降解，長瓣兜蘭提取效果優(yōu)于紫紋兜蘭，而杏黃兜蘭RNA提取效果最差。究其原因，可能是CTAB法操作需靜置過夜，該過程導(dǎo)致RNA有所降解。

Trizol法是植物總RNA簡單快速高效提取的一種經(jīng)典方法。因受不同植物材料和不同植物組織的限制，需要對(duì)傳統(tǒng)Trizol法進(jìn)行改良優(yōu)化以獲得較高質(zhì)量的核酸，以滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究的需要。常見的Trizol法改進(jìn)主要涉及試劑和材料提前預(yù)冷、冰上操作、增加乙醇洗滌次數(shù)和將RNA干燥環(huán)節(jié)置于超凈工作臺(tái)[20-21]等幾個(gè)方面。陳心語等[20]通過將全部實(shí)驗(yàn)操作移至冰上，所有試劑全部預(yù)冷處理，加入異丙醇后-20 ℃放置10 min，RNA干燥環(huán)節(jié)將盛有RNA離心管的冰盒置于超凈工作臺(tái)，短時(shí)間(不超過3 min)鼓風(fēng)干燥等操作對(duì)Trizol試劑法進(jìn)行改良，獲得純度及質(zhì)量均達(dá)到理想狀態(tài)的番茄(Solanumlycopersicum)成熟葉總RNA。王紅波等[21]通過第一步將裂解液至于-70 ℃冰箱過夜，后續(xù)氯仿進(jìn)行重復(fù)抽提、增加乙醇漂洗次數(shù)等步驟的改良，所提取的矮牽牛(PetuniahybridaVilm)衰老花瓣總RNA質(zhì)量好。應(yīng)用Trizol法提取3種兜蘭總RNA，首先通過增加氯仿抽提、異丙醇沉淀和乙醇洗滌環(huán)節(jié)的室溫靜置和離心時(shí)間，并將RNA干燥環(huán)節(jié)置于超凈工作臺(tái)[20]、縮短風(fēng)干時(shí)間[16]等優(yōu)化形成改良Trizol法(Ⅰ)，雖能獲得較完整的總RNA，但純度差。因此，試驗(yàn)在改良Trizol法(Ⅰ)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化形成改良Trizol法(Ⅱ)，提取獲得高質(zhì)量的3種兜蘭屬植物總RNA。改良Trizol法(Ⅱ)的特點(diǎn)是①在原有裂解液的基礎(chǔ)上，加入一定比例的β-巰基乙醇。強(qiáng)還原劑β-巰基乙醇能夠有效去除酚類化合物，防止RNA被氧化；陳宏林等[22]通過優(yōu)化提取液(加入還原劑β-巰基乙醇)獲得了高質(zhì)量紅樹(Mangrove)植物總RNA；張燕梅等[23]通過在提取液中加入β-巰基乙醇獲得了劍麻(Agavesisalana)較高質(zhì)量的總RNA。②在氯仿抽提過程中增加抽提次數(shù)(2次)。氯仿能夠有效除去蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，同時(shí)抑制RNase活性，保證RNA的完整性，提高RNA的質(zhì)量，這也是黃國文等[24]在油茶(Camelliaoleifera)葉片高質(zhì)量總RNA提取方法研究中的觀點(diǎn)；秦亞龍等[16]通過多次氯仿等抽提，獲得質(zhì)量較好的水茄(Solanumtorvum)果實(shí)總RNA。③在異丙醇沉淀步驟中，使用提前預(yù)冷(4 ℃)的異丙醇進(jìn)行RNA沉淀，然后在-20 ℃靜置10 min，消除傳統(tǒng)方法中較長時(shí)間(15～30 min)的室溫放置對(duì)RNA造成的降解。④在后續(xù)采用75 %的乙醇洗滌過程中增加洗滌次數(shù)(2次)，目的是進(jìn)一步去除小離子和殘留的異丙醇[16,21]，有效提高RNA的純度。與傳統(tǒng)Trizol法相比，改良Trizol法(Ⅱ)的提取時(shí)間縮短約25 %，顯著提高了提取效率。

采用RNA試劑盒法、CTAB法、Trizol法(Ⅰ)和改良Trizol法(Ⅱ)提取了3種兜蘭總RNA，比較不同提取方法獲得的總RNA質(zhì)量效果。綜合看，改良Trizol法(Ⅱ)能從紫紋兜蘭、長瓣兜蘭和杏黃兜蘭植物中提取高質(zhì)量總RNA，具備耗時(shí)短、經(jīng)濟(jì)節(jié)約等特點(diǎn)。該方法對(duì)于其他兜蘭屬或蘭科植物總RNA的提取可提供一定的參考意義。

4 結(jié) 論

RNA試劑盒法、改良CTAB法和2種改良Trizol法(Ⅰ和Ⅱ)均能從紫紋兜蘭、長瓣兜蘭和杏黃兜蘭植物葉片中提取總RNA，但總RNA質(zhì)量差異較大。改良Trizol法(Ⅱ)能從3種兜蘭屬植物葉片中提取獲得質(zhì)量最高的總RNA，具備省時(shí)、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。研究建立的3種兜蘭屬植物葉片RNA高效提取的方法，為兜蘭屬植物后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)，也為其他復(fù)雜植物組織總RNA的提取提供了參考。