(浙江司太立制藥股份有限公司,臺(tái)州 317300)

L-乙酰氧基丙酰氯為無(wú)色透明發(fā)煙液體,具有強(qiáng)烈的刺激性氣味,腐蝕性強(qiáng),易與水、醇類化合物等快速反應(yīng),它是合成非離子型碘造影劑碘帕醇的重要原料之一[1]。乙酰氯是L-乙酰氧基丙酰氯合成過(guò)程中的殘留物,也是合成L-乙酰氧基丙酰氯的原料[2]。乙酰氯會(huì)在碘帕醇合成過(guò)程中產(chǎn)生乙?；镫s質(zhì),它很難通過(guò)精制工藝去除,因此,必須嚴(yán)格控制L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯的含量。

由于未檢索到與乙酰氯測(cè)定相關(guān)的文獻(xiàn),考慮到乙酰氯與多氯酰氯相似的化學(xué)性質(zhì),故可借鑒檢測(cè)多氯酰氯的方法來(lái)檢測(cè)乙酰氯。一般采用化學(xué)法測(cè)定多氯酰氯的含量[3],也可采用直接進(jìn)樣-氣相色譜法(GC)[4]測(cè)定,但在采用直接進(jìn)樣-GC測(cè)定多氯酰氯時(shí),易出現(xiàn)進(jìn)樣針、進(jìn)樣口、色譜柱腐蝕及測(cè)定值重現(xiàn)性差等問(wèn)題。因此,有研究者采用酯化-GC[5-7]和衍生化-GC[8-10]測(cè)定多氯酰氯的含量。但采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定多氯酰氯含量的報(bào)道較少,也未見(jiàn)其在乙酰氯測(cè)定方面的應(yīng)用。

本工作先用苯胺將乙酰氯衍生化,然后采用HPLC測(cè)定L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯的含量,以期為L(zhǎng)-乙酰氧基丙酰氯的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和Agilent Open Lab CDS 2.2 工作站。

苯胺溶液:0.6%(體積分?jǐn)?shù)),移取苯胺約0.3 mL于50 mL 容量瓶中,用30%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋至刻度。

乙酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:2.40μL·L－1,移取苯胺約0.3 mL于樣品瓶中,再加入乙酰氯24μL,充分振搖后超聲5 min,加入30%甲醇溶液約1 mL,再超聲1 min,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用30%甲醇溶液稀釋至刻度;再分取該溶液1.0 mL,用30%甲醇溶液定容至100 mL。

乙酰氯對(duì)照品溶液:0.120μL·L－1,移取乙酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5 mL 于10 mL 容量瓶中,用30%甲醇溶液稀釋至刻度。

乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取0.5,0.5,1.0,1.5,2.0 mL乙酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,用30%甲醇溶液定容至100,20,20,20,20 mL,配制成0.012,0.060,0.120,0.180,0.240μL·L－1的乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

苯胺為分析純;甲醇為色譜純;試驗(yàn)用水為純水。

L-乙酰氧基丙酰氯供試品批號(hào)201707001,由新鄉(xiāng)市金升化工有限公司提供;乙酰氯對(duì)照品批號(hào)20130222。

1.2 儀器工作條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;流動(dòng)相為30%甲醇溶液,流量1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm;進(jìn)樣量20μL。

1.3 試驗(yàn)方法

移取苯胺約0.3 mL 于樣品瓶中,加入L-乙酰氧基丙酰氯供試品70μL,充分振搖后常溫超聲5 min,加入30%甲醇溶液1 mL,再超聲1 min,轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,用30%甲醇溶液稀釋至刻度;分取該溶液1.0 mL,用30%甲醇溶液定容至10.0 mL,所得溶液即為供試品溶液。按照儀器工作條件測(cè)定供試品溶液中乙酰氯的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生條件的選擇

苯胺衍生化反應(yīng)可引入苯環(huán)結(jié)構(gòu),便于后續(xù)的紫外檢測(cè)器檢測(cè)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化,最終確定的衍生化反應(yīng)條件為常溫超聲5 min,生成的衍生化產(chǎn)物乙酰苯胺的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 乙酰苯胺的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of acetanilide

由于乙酰苯胺在酸性或堿性溶液中均易分解,故衍生反應(yīng)結(jié)束后,試驗(yàn)通過(guò)向反應(yīng)液中加入近中性的30%甲醇溶液來(lái)保證衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于乙酰苯胺具有紫外吸收峰的苯環(huán)結(jié)構(gòu),采用DAD 在波長(zhǎng)190～400 nm 內(nèi)對(duì)其進(jìn)行了紫外在線掃描,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙酰苯胺的紫外光譜圖Fig.2 UV spectrum of acetanilide

由圖2可知:乙酰苯胺在241.3 nm 處有最大紫外吸收。因此,試驗(yàn)選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

試驗(yàn)比較了十八烷基硅膠柱 VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)和ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)對(duì)乙酰苯胺的分離效果。結(jié)果顯示:ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)得到的乙酰苯胺的色譜峰峰形及分離效果較好,因此,試驗(yàn)選擇ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)為分離柱。

2.3.2 流動(dòng)相

試驗(yàn)比較了分別以甲醇溶液和乙腈溶液為流動(dòng)相時(shí)乙酰苯胺的分離效果。結(jié)果顯示,兩種流動(dòng)相下得到的乙酰苯胺的分離度均大于2.0。由于甲醇溶液作流動(dòng)相更常用,因此,試驗(yàn)選擇甲醇溶液作流動(dòng)相。

試驗(yàn)還比較了甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)分別為30%和40%時(shí)對(duì)乙酰苯胺的分離效果。結(jié)果顯示,前者獲得的乙酰苯胺的分離度可以達(dá)到2.0以上,故試驗(yàn)選擇30%甲醇溶液作為流動(dòng)相。

2.4 專屬性試驗(yàn)

按照儀器工作條件測(cè)定苯胺溶液、乙酰氯對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液(由體積比為1∶20乙酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和供試品溶液混合而成),所得結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知:衍生化后,產(chǎn)生了乙酰苯胺的色譜峰,其與苯胺的分離度在2.0以上;加標(biāo)供試品溶液中還出現(xiàn)了L-乙酰氧基丙酰苯胺的色譜峰和樣品中帶來(lái)的未知雜質(zhì)的色譜峰,分離度也均在2.0以上,說(shuō)明方法的專屬性較好。

圖3 苯胺溶液、乙酰氯對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of aniline solution,acetyl chloride control solution and spiked test solution

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行衍生化后,按照儀器工作條件測(cè)定,以乙酰氯的體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)衍生物乙酰苯胺的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.012～0.240μL·L－1,線性回歸方程為y＝121.0x＋0.130 1,相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),所得結(jié)果為0.006μL·L－1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)加標(biāo)量分別為0.062,0.120,0.180μL·L－1的供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示:3種加標(biāo)水平下的回收率分別為94.8%,94.2%,92.7%,測(cè)定值的RSD 分別為5.5%,8.3%,2.9%。

取同一批樣品,按照試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次,所得測(cè)定值的RSD 為8.9%。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法分析供試品,檢出乙酰氯在供試品中的體積分?jǐn)?shù)為0.16%。

本工作采用苯胺衍生化-HPLC 測(cè)定了L-乙酰氧基丙酰氯中的乙酰氯,本方法衍生化反應(yīng)快速、回收率高、精密度好,可作為L(zhǎng)-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯(雜質(zhì))控制的一種可靠的分析方法。