劉艷玲 袁 娟 郭 敏 張延鋒 陸君君 曹 巍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，新鄉(xiāng)453003）

肺癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率和病死率中位居第一，盡管新的診斷和治療方法不斷發(fā)展，但每年仍有約210萬(wàn)例患者被確診為肺癌，約180萬(wàn)例死亡病例［1］。研究表明，免疫功能紊亂是肺癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)，多數(shù)惡性腫瘤患者存在免疫功能紊亂，其中Th1和Th2細(xì)胞失衡可引發(fā)免疫逃避，是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制［2-3］。隨著腫瘤與免疫功能關(guān)系的研究深入，腫瘤免疫治療成為放化療和手術(shù)治療之外的重要治療手段，改善腫瘤患者的免疫功能狀態(tài)是肺癌防治的關(guān)鍵。黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，含有黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）、黃芪黃酮和黃芪皂苷等成分［4］。APS是黃芪的主要水溶性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種功效，是有效的抗腫瘤藥物和免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于臨床［5-6］。Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）在識(shí)別病原體和激活先天免疫系統(tǒng)中起重要作用，Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是第一個(gè)被鑒定的TLR蛋白，可識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌脂多糖［7］。TLR4信號(hào)通路的關(guān)鍵分子包括TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路激活可導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡，加快炎癥發(fā)展［8］。研究報(bào)道，APS可直接作用于巨噬細(xì)胞表面TLR4，可通過(guò)TLR4介導(dǎo)MAPKs和NF-κB活化誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子［9-10］。但APS對(duì)肺癌患者是否通過(guò)TLR4信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用尚未明確。本研究采用C57BL/6J野生型（TLR4+/+）和TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠構(gòu)建Lewis小鼠肺癌模型，以TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，觀察APS對(duì)Lewis肺癌小鼠的腫瘤抑制作用和免疫功能的影響及其對(duì)Th1/Th2的調(diào)節(jié)作用，初步探究其作用機(jī)制，為肺癌臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 SPF級(jí)C57BL/6J野生型（TLR4+/+）小鼠50只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）；TLR4-/-小鼠50只（美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室），6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，研究方案獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 APS（上海一基實(shí)業(yè)有限公司，純度＞90%）；注射用順鉑（齊魯制藥）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；紅細(xì)胞裂解液、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)Thermo Scientific）；引物（日本TaKaRa）；CD3、CD4、CD8a大鼠抗小鼠單抗（美國(guó)BD公司）；IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；TLR4、MyD88、NF-κBp65兔源單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；超凈工作臺(tái)、Multiskan MK3酶標(biāo)儀；AE223電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；IX53顯微鏡（日本奧林巴斯）；TGL16MB高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 C57BL/6J野生型（WT）TLR4+/+和TLR4-/-小鼠各隨機(jī)分為模型組、順鉑組、APS高、中、低劑量組，每組10 TLR+/+，分別建立Lewis肺癌移植瘤模型。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞，生理鹽水重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，皮下注射于小鼠右前肢腋窩，0.2 ml/只，接種第7天小鼠右側(cè)腋下可觸到黃豆大小腫塊提示造模成功。

1.2.2 給藥方法 造模第2天，APS高、中、低劑量組小鼠灌胃給予400、200、100 mg/kg APS溶液（臨用前蒸餾水配制），0.2 ml/10 g，模型組小鼠灌胃給予等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)14 d；順鉑組小鼠腹腔注射順鉑注射液（3 mg/kg），200μl/20 g，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.3 腫瘤抑制率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定 最后1次給藥后2 h處死小鼠，稱(chēng)重，分離小鼠腫瘤組織、胸腺，稱(chēng)重。超凈臺(tái)中分離小鼠脾組織，稱(chēng)重。腫瘤抑制率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%；胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺質(zhì)量（mg）/體重（g）；脾指數(shù)（mg/g）=脾質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.2.4 HE染色檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織病理變化分離小鼠腫瘤組織，多聚甲醛固定48 h，洗凈，梯度乙醇脫水，制作肺組織蠟塊，冰上預(yù)冷，切片（4μm），置于載玻片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇復(fù)水，蘇木精和伊紅染液分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色，脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤組織病理變化。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群水平 無(wú)菌環(huán)境下分離小鼠脾組織，剪碎，置于70μm細(xì)胞篩網(wǎng)中研磨，至組織塊全部通過(guò)篩網(wǎng)，收集組織懸液，300 g離心5 min，棄上清，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液冰上裂解5～10 min，300 g離心5 min，棄上清，含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，重復(fù)洗滌、離心2次，培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。取小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液加入流式管，100μl/管，加入熒光標(biāo)記的CD3、CD4、CD8a單抗，混勻，室溫避光孵育20 min，加入2 ml PBS緩沖液，300 g離心5 min，棄上清，加入0.5 ml PBS緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞亞群水平。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠脾組織Th1和Th2細(xì)胞因子含量 稱(chēng)取各組小鼠脾組織置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的PBS緩沖液（1∶5）充分研磨，5 000 g離心10 min，收集上清。取各組待測(cè)樣品加入反應(yīng)孔，100μl/孔，每組分別設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37℃孵育90 min，棄孔內(nèi)液體，加入100μl生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄孔內(nèi)液體，洗滌3次，加入100μl酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min，棄孔內(nèi)液體，洗滌5次，90μl/孔加入底物溶液，37℃孵育15 min，加入50μl終止液，450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組小鼠脾組織中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)腫瘤組織TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取0.1 g小鼠腫瘤組織剪碎后冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取肺組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，放入10 ml TLR4、MyD88、NF-κB p65兔源一抗稀釋液（1∶1 000）中，4℃孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗3次，10 min/次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000）中，37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次，ECL發(fā)光，反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析各蛋白灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.2.8 qRT-PCR檢測(cè)腫瘤組織TLR4、MyD88、NFκB mRNA表達(dá) 稱(chēng)取0.1 g小鼠腫瘤組織，冰上研磨，加入1 ml Trizol裂解液提取總RNA，RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物由日本TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5μl+5×Buffer 2.5μl+Taq酶0.3μl+MgCl21.5μl+cDNA模板2μl+上下游引物分別1μl，加去離子水至總體積為25μl。反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應(yīng)，2-ΔΔCt法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 8.0繪制圖片，計(jì)量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制率、腫瘤瘤質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 順鉑組、APS高、中、低劑量組小鼠腫瘤抑制率分別為47.27%、45.00%、38.64%、30.00%；與模型組相比，順鉑組、APS高、中、低劑量組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低，順鉑組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低，APS高、中劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著升高，低劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與順鉑組相比，APS高劑量組小鼠腫瘤質(zhì)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、低劑量組小鼠腫瘤質(zhì)量高于順鉑組，APS高、中、低劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著升高，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05，圖1）。

2.2 APS對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核輪廓清晰，細(xì)胞核較大，顏色深，生長(zhǎng)旺盛，無(wú)壞死現(xiàn)象，可見(jiàn)血管新生；與模型組相比，順鉑組小鼠腫瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域，細(xì)胞核固縮；APS各組小鼠腫瘤組織出現(xiàn)不同程度和不同面積的片狀細(xì)胞壞死區(qū)域，細(xì)胞核固縮，新生血管減少，且呈劑量依賴(lài)性（圖2）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.3 APS對(duì)Lewis肺癌小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響 與模型組相比，順鉑組小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，APS高、中劑量組小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平顯著升高，APS高劑量組CD4+/CD8+比值升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，APS高、中劑量組小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平升高，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05），CD4+/CD8+比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

2.4 APS對(duì)Lewis肺癌小鼠脾組織Th1/Th2細(xì)胞因子水平的影響 與模型組相比，順鉑組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4和IL-10含量升高，APS高、中、低劑量組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）；與順鉑組相比，APS高、中、低劑量組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05，圖4）。

圖1 各組Lewis肺癌小鼠腫瘤質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較Fig.1 Comparison of tumor weight，thymus index and spleen index of Lewis lung cancer mice in each group

圖2 APS對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化的影響（×400）Fig.2 Effect of APSon pathological changes of tumor tissues of Lewis lung cancer mice（×400）

圖3 各組Lewis肺癌小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群水平比較Fig.3 Comparison of levels of splenic lymphocyte subsets in Lewis lung cancer mice

圖4 各組小鼠脾組織Th1和Th2細(xì)胞因子含量比較Fig.4 Comparison of Th1 and Th2 cytokines in spleen tissues of mice in each group

圖5 各組Lewis肺癌小鼠腫瘤組織TLR4，MyD88，NFκB表達(dá)Fig.5 Expressions of TLR4，MyD88 and NF-κB proteins in Lewislung cancer mice

圖6 各組小鼠脾組織Th1和Th2細(xì)胞因子含量比較Fig.6 Comparison of Th1 and Th2 cytokines in spleen tissues of mice in each group

2.5 TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)APS抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用 為鑒定APS是否通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，課題組采用APS處理TLR4+/+和TLR4-/-Lewis肺癌小鼠，觀察不同濃度APS對(duì)2種類(lèi)型小鼠腫瘤瘤組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)的影響及對(duì)小鼠脾組織Th1/Th2細(xì)胞因子水平的影響。Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，與模型組相比，順鉑組、APS高、中、低劑量組TLR4+/+小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白和mRNA表達(dá)降低，與順鉑組相比，APS高、中劑量組小鼠腫瘤組織中TLR4表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組小鼠腫瘤組織中TLR4表達(dá)高于順鉑組，高劑量組小鼠MyD88和NF-κBp65表達(dá)降低，中劑量組小鼠MyD88和NF-κBp65表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組小鼠MyD88和NF-κB p65表達(dá)顯著高于順鉑組（P＜0.05）。相反的是，與模型組相比，順鉑組TLR4-/-小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NFκB p65表達(dá)降低，但APS高、中、低劑量組小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，順鉑組TLR4+/+小鼠IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4和IL-10含量升高，APS高、中、低劑量組IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。與TLR4+/+小鼠相反，與模型組相比，順鉑組TLR4-/-小鼠IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4和IL-10含量升高，而APS高、中、低劑量組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且APS高、中、低劑量組TLR4-/-小鼠IL-2和IFN-γ含量均低于TLR4+/+小鼠相應(yīng)APS治療組，IL-4和IL-10含量均高于TLR4+/+小鼠相應(yīng)APS治療組（P＜0.05，圖6）。

3 討論

肺癌是全球范圍發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，大部分肺癌患者在首診時(shí)已為晚期，化療是肺癌患者，尤其是晚期肺癌患者的主要治療方案［11-12］?；熕幬镌跉⑺滥[瘤細(xì)胞的同時(shí)導(dǎo)致人體免疫功能下降，損傷免疫器官，因此，免疫治療已成為放化療和手術(shù)治療之外的重要治療手段［13］。研究表明，中藥及其有效成分可通過(guò)提高腫瘤患者免疫功能干擾腫瘤細(xì)胞增殖和代謝過(guò)程，促進(jìn)其凋亡［14］。APS是黃芪的主要有效成分，在體內(nèi)和體外均可抑制肺癌細(xì)胞增殖，改善化療所致的免疫功能低下，對(duì)化療具有減毒增效作用，但具體作用機(jī)制尚不明確［15］。TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路活化多發(fā)生于炎癥和免疫反應(yīng)，與惡性腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力呈正相關(guān)［16］。推測(cè)APS可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控肺癌小鼠免疫功能，產(chǎn)生抗腫瘤作用。因此，本研究以TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，觀察APS對(duì)肺癌小鼠免疫功能的影響并初步探究其作用機(jī)制。

目前，APS已被廣泛用于癌癥患者的補(bǔ)充和替代治 療［17-18］。YE等［19］報(bào) 道，APS可抑制 乳 腺癌MDA-MB-468細(xì)胞生長(zhǎng)并增強(qiáng)順鉑療效。YANG等［20］通過(guò)小鼠H22肝癌異種移植瘤模型研究APS對(duì)肝癌的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性發(fā)現(xiàn)，APS通過(guò)改善機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤活性，改善小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，提高巨噬細(xì)胞吞噬功能。本研究中，順鉑組、APS、中、低劑量組小鼠的腫瘤抑制率分別為47.27%、45.00%、38.64%、30.00%，與模型組相比，APS劑量依賴(lài)性抑制Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)，高劑量APS腫瘤抑制作用與順鉑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明APS具有顯著抗Lewis肺癌作用，與既往研究結(jié)果相似。胸腺和脾是人體重要免疫器官，也是T淋巴細(xì)胞成熟和分化的場(chǎng)所，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)［21］。T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，CD3+T細(xì)胞代表總T細(xì)胞水平，主要反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物不同，T淋巴細(xì)胞分為CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞2個(gè)主要亞群，CD4+T淋巴細(xì)胞可提高免疫功能，CD8+T淋巴細(xì)胞則相反，CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞在正常機(jī)體中處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)平衡被打破，機(jī)體免疫功能則出現(xiàn)紊亂［22］。研究表明，APS可提高乳腺癌荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，并提高巨噬細(xì)胞分泌免疫調(diào)節(jié)因子的能力［23］。本研究中，APS可呈劑量依賴(lài)性提高小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，提高CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+比值，表明APS可顯著提高肺癌小鼠免疫功能。輔助性T細(xì)胞（helper Tcells，Th）是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，包括Th1和Th2 2個(gè)亞型，正常情況下，機(jī)體Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡，但惡性腫瘤患者體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子分泌增多，出現(xiàn)Th1/Th2漂移現(xiàn)象，導(dǎo)致Th1/Th2失衡［24］。WU等［25］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)用可恢復(fù)肺癌小鼠血清Th1細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)，抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)生存期。本研究中，與模型組相比，順鉑組小鼠脾組織中Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量降低，Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10含量升高，APS高、中、低劑量組小鼠脾組織IL-2和IFN-γ含量顯著升高，IL-4和IL-10含量顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性，表明APS可逆轉(zhuǎn)Th1/Th2漂移，恢復(fù)Th1/Th2型細(xì)胞因子平和，與既往研究結(jié)果一致。

MyD88是TLRs家族下游炎癥通路的經(jīng)典分子，MyD88通過(guò)TLR家族成員與IL-1R相關(guān)激酶（IRAK）家族相互作用激活NF-κB信號(hào)通路，釋放炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)［8］。DING等［26］研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因過(guò)表達(dá)可顯著降低二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生率。ZHANG等［27］研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/NF-κB/MMP-9信號(hào)通路可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，提高caspase-3/9活性。為探究APS是否通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，課題組分別給予TLR4+/+和TLR4-/-Lewis肺癌小鼠APS，觀察不同濃度APS對(duì)2種類(lèi)型小鼠腫瘤組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響和對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子水平的影響，結(jié)果顯示，在TLR4+/+小鼠中，APS呈劑量依賴(lài)性降低小鼠腫瘤組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白和mRNA表達(dá)，提高脾組織Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量，降低Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10含量；與TLR4+/+小鼠相反，在TLR4-/-小鼠中，不同濃度APS組小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白和mRNA表達(dá)及脾組織Th1/Th2細(xì)胞因子含量與模型組小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明APS可能通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)途徑發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，APS可抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)，提高肺癌小鼠免疫功能，逆轉(zhuǎn)和平衡Th1/Th2漂移現(xiàn)象，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88/NFκB信號(hào)通路活化有關(guān)。