雌雄同株黃檗有性繁殖特性研究

范永芳，徐 碩，張 昭，于 晶，魏雪蘋，賀利宏

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193）

0 引言

蕓香科黃檗屬植物黃檗為傳統(tǒng)意義上的雌雄異株植物。但筆者在2018年首次發(fā)現(xiàn)了多株雌雄同株黃檗，稱之為兩性植株，此前未曾有過關于黃檗性別可塑性報道。這些兩性植株主干在幼年時上端死亡，于15.8～30.7 cm處分杈，形成不同性別的分枝，雌枝平均周長31.1 cm，雄枝平均周長23.2 cm。經過連續(xù)3年觀察，發(fā)現(xiàn)不同性別分枝性別表達穩(wěn)定，未發(fā)生性別轉換。之前也有少量的研究報道過在雌雄異株居群中發(fā)現(xiàn)罕見的兩性植株個體，兩性植株個體的性別表達方式多為在雄株上發(fā)現(xiàn)少量雌花，如胡楊[1]、銀杏[2]、連香樹[3]和紅豆杉[4]；或是雄花和雌花無規(guī)律的分布在植株上，如黃連木[5]。筆者所發(fā)現(xiàn)的兩性黃檗的性別表達方式與上述有所不同，不同性別分枝的性別表達方式在以往研究中也未見報道，兩性黃檗植株的發(fā)現(xiàn)豐富了植物性別表達方式的多樣性。

兩性黃檗植株主干均較短，分枝分化為不同性別?？赡苁怯捎诒本┒咎鞖飧衫鋵е掠酌缟喜扛煽?，側芽分化為不同性別而形成的。筆者推測，黃檗的性別由表觀遺傳方式決定，在年幼時植株可能不存在性別，在一定的樹齡才分化出性別，不同的分枝分化為不同的性別，這在植物中還未曾報道過。但在動物研究中早就發(fā)現(xiàn)，低等動物中的兩棲類和魚類，在生長發(fā)育的某一階段形成性別并維持穩(wěn)定，如蜥蜴、鱷魚和龜鱉，在孵化前的某一時期受溫度影響并以表觀遺傳的方式分化出不同的性別[6-7]。也有可能黃檗在年幼時已有性別分化，但性別表達并不穩(wěn)定，在一定樹齡時穩(wěn)定表達，不同分枝穩(wěn)定表達為不同性別。如槭樹等植物在樹齡較小時植株偏向于雄性表達，較大時偏向于雌性表達[8-10]。兩性植株黃檗的發(fā)現(xiàn)，為研究植物性別決定與分化提供了新的思路和材料。

黃檗的兩性植株在同一植株上同時擁有大量的雄花和雌花，可以克服較遠距離花粉傳播的困難，這對于黃檗野生資源保護和種群恢復具有重要意義。黃檗曾遍布于歐亞及美洲大陸，幾經變遷后龜縮于亞洲東部部分地區(qū)[11-12]，根據(jù)《中國植物志》記載，現(xiàn)黃檗主要分布于中國東北地區(qū)、華北部分省區(qū)及朝鮮、日本和俄羅斯[12]。在20世紀時野生黃檗資源遭到了濫砍亂伐，棲息地受到嚴重破壞，導致野生資源零星分布，集中分布面積極小[11,13-14]。根據(jù)張志鵬的調查，發(fā)現(xiàn)野生黃檗主要分布在長白山、張廣才嶺和小興安嶺南部等地，較之原來的數(shù)據(jù)，分布范圍進一步縮小[14-15]。調查還發(fā)現(xiàn)野生黃檗分布呈現(xiàn)嚴重的碎片式和零星化，在燕山、千山、長白山、張廣才嶺和小興安嶺5條山脈的38個樣點中僅發(fā)現(xiàn)966株野生黃檗，平均種群密度只有25.4株/(km·m)[15]。這種分布模式對于雌雄異株的黃檗而言，花粉遠距離傳播障礙難以克服，不利于繁衍和種群的自我更新。黃檗作為第三紀古熱帶植物區(qū)系孑遺植物，對于研究物種進化、古植物區(qū)系以及古氣候變化有重要意義[14,16-17]，且黃檗是大宗藥材“關黃柏”的基源植物和優(yōu)良的木材原料，對于經濟的發(fā)展也有重要意義，因此保護黃檗資源刻不容緩。黃檗已經先后被列入《中國珍稀瀕危保護植物名錄》和《國家重點保護野生植物名錄》，成為國家級保護物種[18]，有關部門已經對野生黃檗采取了強有力的保護措施。但由于野生資源的嚴重破壞，其繁衍和自我更新面臨極大困難[11,19-20]。兩性植株的出現(xiàn)可以彌補這一缺失，克服黃檗碎片式分布導致的授粉困難[11,14,21]，在一定程度上有利于野生黃檗植株進行成功的有性繁殖，使筆者對野生黃檗種群恢復增加了更多的希望。

繁殖是生物生存的關鍵[22]，兩性黃檗植株能否和雄株和雌株一樣正常執(zhí)行雄性功能和雌性功能具有重要意義，也為進一步的實驗提供基礎，因此筆者分別對兩性植株的雄性功能和雌性功能進行了研究。花粉和柱頭在有性繁殖中具有重要作用，是傳粉系統(tǒng)的重要組成[23]，其表觀形態(tài)對授粉具有較大的影響，筆者首先對黃檗兩性植株花粉和柱頭的形態(tài)和花粉活力進行觀察。并于2019年和2020年連續(xù)2年通過人工授粉和自然受粉方式，對兩性植株雄性繁殖能力、雌性繁殖能力和自交繁殖能力3個方面進行評估，以描述兩性植株的繁殖能力。

1 材料與方法

1.1 材料

兩性黃檗植株為北京藥用植物園(40.03°N；116.27°E)保育黃檗個體。研究涉及4株個體，2株為2005年北京種源播種，2株為1999年從吉林省移植；對照植株均為同源保育材料中的單性植株個體。物種由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所張昭研究員鑒定為蕓香科黃檗屬植物黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)。實驗在北京藥用植物研究所中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，于2018年5月—2020年10月進行。

1.2 方法

1.2.1 兩性植株雄性功能研究

（2）花粉形態(tài)觀察。將干燥后的花粉置于金屬靶上，JFC-1600離子濺射儀鍍金膜，用JSM-6510LV掃描電子顯微鏡以合適的倍數(shù)觀察花粉形態(tài)和表面紋飾，測量花粉極軸和赤道軸長度。兩性植株和雄株花粉各測量49個。每種花粉選取10個×200倍數(shù)的視野，觀察并記錄正常花粉和畸形花粉的數(shù)量，計算花粉的畸形率。

（3）花粉活力檢測。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法觀察花粉萌發(fā)率，采用肖美林等人的培養(yǎng)基：10%蔗糖+0.008%硼酸+0.02%硝酸鈣+5g/L瓊脂[24]；用毛筆蘸取花粉，均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，放入25℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后進行觀察。共設置光照、黑暗和光照/黑暗(2h/2h)3種培養(yǎng)條件處理，每個處理3個重復。在體視顯微鏡下觀察，每個培養(yǎng)皿選取5個視野，觀察并記錄花粉萌發(fā)情況，計算花粉萌發(fā)率。

（4）雄性繁殖能力研究。分別在2019年和2020年通過人工授粉方式，花粉為雌株授粉，以雄株花粉為對照，統(tǒng)計果實和種子數(shù)量判斷兩性植株雄性繁殖能力。在開花前2日給雌花序套袋，從雌花序第一朵花開放開始，每日進行授粉，直至最后一朵花授粉后結束，在群體花期結束后去袋。兩性植株花粉共授粉51個花序，1785朵雌花；雄株花粉共授粉51個花序，1954朵雌花。果實成熟時采摘果序，記錄果實數(shù)以及單果中種子數(shù)。

1.2.2 兩性植株雌性功能研究

（1）柱頭形態(tài)觀察：采集花蕾期、開花1天和開花2天的雌花，F(xiàn)AA固定液[25]固定。梯度乙醇脫水，乙醇-叔丁醇逐級替換直至100%叔丁醇，ALPHA2-4LD PLUS冷凍干燥器干燥[25-27]，干燥后的柱頭于金屬靶上，JFC-1600離子濺射儀鍍金膜，用JSM-6510LV掃描電子顯微鏡以合適的倍數(shù)觀察柱頭形態(tài)，并拍照記錄，以雌株的柱頭為對照進行比較。

（2）雌花繁殖能力研究：分別在2019年和2020年，通過人工授粉的方式，以雄株花粉為兩性植株的雌花和雌株的花授粉，授粉方式同上。兩性植株授粉19個花序，762朵雌花；雌株授粉19個花序，680朵雌花。待果實成熟后采摘果序，記錄果實數(shù)以及單果中種子數(shù)。

目前洋地黃毒苷臨床已很少應用，所以市面上很難買到。為保留該實驗項目，我們對實驗進行了改進。用維拉帕米（鈣通道阻滯劑，臨床主要用于治療心律失常）[4]作為取代藥，以異丙腎上腺素為工具藥來區(qū)分普萘洛爾和維拉帕米對心臟的抑制作用及其作用機制。

2020年采集兩性植株和雌株于自然受粉條件下生長的果序進行比較，記錄開花數(shù)、果實數(shù)以及單個果實中種子數(shù)，兩性植株采摘19個果序，共767個果實，雌株采摘19個果序，共672個果實。

1.2.3 兩性植株自交繁殖能力研究 分別在2019年和2020年，通過人工授粉的方式，以兩性植株的花粉對該植株雌花進行授粉，共授粉19個花序，523朵花；以雄株花粉對兩性植株雌花授粉為對照，共授粉19個花序，762朵花，授粉方式如上，待果實成熟后采摘果序，記錄果實數(shù)以及單果中種子數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Excel和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行整理，采用獨立樣本T檢驗和非參數(shù)檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 兩性植株雄性功能研究

2.1.1 花粉形態(tài) 共觀察654個兩性植株花粉，760個雄株花粉，發(fā)現(xiàn)花粉均為單粒三溝花粉，萌發(fā)溝延伸到兩極，赤道面觀呈長圓形，極面觀呈三葉圓形（圖1）。根據(jù)王開發(fā)等[28]對花粉形狀類型的分類標準，這2種花粉均屬于長球形(1.14＜P/E＜2)?；ǚ弁獗诒痪W(wǎng)狀紋飾覆蓋，并有點狀凸起裝飾網(wǎng)格內部。

圖1 兩性植株和雄株花粉的亞顯微結構

隨機選擇兩性植株和雄株花粉各49個，測量花粉極軸和赤道軸長，詳見表1。兩性植株花粉極軸長平均為40.93±1.75 μm，赤道軸長平均為22.67±1.21 μm，P/E值平均為1.81±0.10。雄株花粉的極軸長平均為40.89±1.76 μm，赤道軸長平均為22.81±1.27 μm，P/E值平均為1.80±0.12。統(tǒng)計分析結果表明，2種花粉在極軸長、赤道軸長和P/E上均沒有差異，因此兩性植株花粉在大小上與雄株花粉發(fā)育情況相同。

觀察并記錄10個視野中總花粉數(shù)量和畸形花粉數(shù)量，詳見表1。兩性植株花粉的畸形率平均為13.89±5.31%，雄株花粉的畸形率平均為10.02±3.80%。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，兩性植株花粉的畸形率與雄株花粉相比沒有差異，兩種花粉發(fā)育的水平相當。

表1 花粉形態(tài)觀察結果

2.1.2 花粉活力 在光照、黑暗和光照/黑暗3種環(huán)境下觀察花粉的萌發(fā)率（詳見表2）。兩性植株花粉在3種條件下的萌發(fā)率分別為23.23±8.17%、34.30±11.47%、26.13±9.95%，黑暗中花粉的萌發(fā)率較高；雄株花粉在3種條件下萌發(fā)率沒有差異，分別為25.50±14.45%、26.73±14.64%、25.60±16.10%。在光照和光照/黑暗條件下兩性植株花粉的萌發(fā)率與同一條件下的雄株花粉沒有差異，但在黑暗條件下，兩性植株花粉的萌發(fā)率明顯高于雄株花粉。因此，兩性植株花粉的活力在光照和光照/黑暗條件下與雄株花粉在同一水平，在黑暗條件下則高于雄株花粉。

表2 兩性植株與雄株花粉萌發(fā)率比較 %

2.1.3 雄性繁殖能力 用兩性植株花粉給雌株授粉，共授粉51個花序，1785朵花，采收到1563個果實；用雄株花粉給雌株授粉，共授粉51個花序，1954朵花，采收到1767個果實（詳見表3）。兩性植株花粉授粉的得果率平均為86.69±13.90%，雄株花粉授粉的得果率平均為87.72±15.78%，兩種花粉授粉后的得果率沒有差異。

表3 兩性植株雄性繁殖能力評估

在種子數(shù)量上，對376個兩性植株雄花授粉和雄株花粉授粉所得果實的種子進行計數(shù)，兩性植株授粉共得到1301個種子，單果種子數(shù)平均為3.46±1.18；雄株花粉授粉共得到1410個種子，單果種子數(shù)平均為3.75±1.13。兩性植株花粉所育果實中平均種子數(shù)比雄性植株花粉所育果實中平均種子數(shù)少0.28，明顯少于雄株。

上述結果說明，兩性植株花粉在花粉的形態(tài)和得果率方面與雄株花粉沒有差異，但在所育果實中種子數(shù)明顯少于雄株花粉，兩性植株花粉在產生后代的數(shù)量上略差。總體而言，兩性植株能夠成功執(zhí)行雄性功能，具有繁殖能力，但在產生后代數(shù)量的能力上略差。

2.2 兩性植株的雌性功能研究

2.2.1 柱頭形態(tài) 通過掃描電鏡對不同開花天數(shù)的21個柱頭進行了觀察，其中兩性植株柱頭11個，雌株柱頭10個。觀察發(fā)現(xiàn)，兩種柱頭表面形態(tài)相似（如圖2），柱頭呈近五邊形，表面由乳突細胞組成，花蕾期和開花初期可觀察到兩類乳突細胞，一類細胞飽滿，頂端不平整，另一類細胞不飽滿，頂端向下凹陷，表面具有浸出物。隨著開花天數(shù)的增加，兩性植株和雌株的柱頭整體形態(tài)不發(fā)生改變，乳突細胞隨時間形態(tài)有所改變，飽滿的乳突細胞頂端逐漸凹陷，點狀凸起和表面浸出物逐漸增多。

圖2 兩性植株和雌株柱頭的顯微結構

兩性植株柱頭和雌株柱頭形態(tài)基本一致，但雌株柱頭乳突細胞從飽滿到凹陷的時間較快，在開花2天的柱頭上基本無飽滿乳突細胞存在，浸出物也多于兩性植株柱頭。乳突細胞形態(tài)的變化與功能是否存在關聯(lián)以及花粉在兩類乳突細胞上的萌發(fā)和生長是否存在差異需要進一步的觀察。

2.2.2 雌性繁殖能力 用雄株花粉分別對兩性植株和雌株的雌花進行人工授粉，分別授粉19個花序。兩性植株共授粉762朵花，采收到697個果實；雌株共授粉680朵花，采收到636個果實（詳見表4）。兩性植株得果率平均為91.30±8.51%，雌株得果率平均為91.56±7.98%，二者不存在差異。筆者還對兩性植株和雌株自然受粉花序的結果狀況進行了觀察，分別觀察了19個花序，兩性植株的得果率平均為95.69±3.80%，雌株的得果率平均為87.30±17.61%，二者之間同樣不存在差異。

表4 兩性植株雌性繁殖能力評估

在種子數(shù)量上，對人工授粉的182個果實的種子進行計數(shù)，兩性植株共得到729個種子，單果種子數(shù)平均為4.01±0.91；雌株共得到685個種子，單果種子數(shù)平均為3.68±1.16，兩性植株顯著高于雌株。分別對自然受粉兩性植株和雌株的233個果實的種子進行計數(shù)，兩性植株共得到924個種子，單果種子數(shù)平均為3.97±1.07；雌株共得到862個種子，單果種子數(shù)平均為3.70±1.21，兩性植株同樣顯著高于雌株。

在人工授粉條件下，花粉充盈，通常而言后代應多于或等于自然受粉。在本實驗中，雌株在人工授粉和自然受粉條件下，得果率和單果種子數(shù)均無顯著差異。兩性植株在人工授粉條件下的得果率顯著小于自然受粉，單果種子數(shù)沒有顯著差異。差異的產生可能與光照有光，相對自然受粉，人工授粉的花序位于植株的下端，不如自然受粉的花序接受陽光充足，或許導致果實的發(fā)育不如上端的花序。

由上可知，兩性植株柱頭的形態(tài)和發(fā)育過程與雌株基本一致，在人工授粉和自然受粉2種條件下，兩性植株能夠產生與雌株相差無幾的果實，且單果種子數(shù)高于雌株，表明兩性植株柱頭的可授性可能要強于雌株。因此，兩性植株雌性不僅能夠成功繁殖后代，而且在產生后代數(shù)量的能力上要高于雌株。

2.3 兩性植株自交繁殖能力研究

為了考察兩性植株的自交繁殖能力，筆者對兩性植株進行自株授粉和異株授粉（詳見表5），分別為19個花序，自株授粉523朵花，采集到475個果實；異株授粉762朵花，采集到697個果實。兩性植株自交得果率平均為88.01±11.86%，異交得果率平均為91.30±8.51%，二者沒有顯著差異。

表5 兩性植株自交繁殖能力評估

在種子數(shù)量上，分別對182個果實的種子進行計數(shù)，兩性植株自交共得到718個種子，單果種子數(shù)平均為3.94±1.05；異交共得到729個種子，單果種子數(shù)平均為4.01±0.91，二者之間沒有顯著差異。

由上可知，兩性植株自交能夠成功繁殖后代，與異交相比，兩者在得果率和單果種子數(shù)上并沒有差異，兩性植株自交繁殖能力與異交處于同一水平，不存在自交不親和現(xiàn)象。

3 討論

根據(jù)筆者的研究結果，兩性黃檗植株具有不低于正常植株的繁殖能力，在自然條件下可以成功繁殖后代。這也意味著兩性植株單株可以產生很多果實，與胡楊等的兩性植株不同[1-3]。結合3年觀察結果，兩性植株性別表達不發(fā)生變化，可以推斷出兩性黃檗植株能夠穩(wěn)定的存在，并具有重要的生存意義。兩性黃檗植株雄性和雌性均具有繁殖能力，即雄性和雌性均具有繁殖意義，為黃檗繁殖系統(tǒng)的相關研究提供了基礎，也為其性別形成與分化研究提供了方向，但黃檗性別機制還需要進一步研究。兩性植株可以自交繁殖，單株即可完成生殖，保障物種的繁衍，可以在一定程度上克服野生黃檗種群個體分散、零星分布格局導致的傳粉困難，有利于黃檗資源的恢復和群落生物多樣性水平的維護。但野生黃檗中是否存在兩性黃檗、個體數(shù)量如何還有待于系統(tǒng)的野外調查。

在雌雄異株種群中出現(xiàn)少量的雌雄同株植株時，該居群稱為“亞雌雄異株”[29]。有學者指出亞雌雄異株居群的出現(xiàn)只是植物進化發(fā)育過程中的“意外”，因為植物不一定能夠精確的控制性別表達，在遭遇某些復雜的環(huán)境后可能產生一些罕見或是不規(guī)律的個體，并無意義[30]。也有學者不同意上述觀點，認為亞雌雄異株種群的出現(xiàn)是植物為了適應非生物環(huán)境而發(fā)生的改變[31-33]。植物所處的環(huán)境并非一成不變，大量研究發(fā)現(xiàn)，當所處環(huán)境不利于植物生長時植株更偏向雄性，當環(huán)境利于植物生長時植株更偏向于雌性[34]，同時擁有雄性和雌性的兩性植株能夠更好地適應不同的環(huán)境[35]。黃檗的兩性植株同時擁有兩種性功能，能夠在低密度的環(huán)境下維持生存和繁衍，其適應環(huán)境能力可能高于雌雄異株植株。有學者指出成功的繁殖依賴于植株良好的適應性[36]，但黃檗兩性植株的出現(xiàn)是由于“意外”，或是對不利環(huán)境的主動應對還有待進一步的研究。

4 結論

兩性植株的雄性和雌性繁殖器官較之雄株和雌株，在形態(tài)和發(fā)育上基本沒有差異。在繁殖能力方面，兩性植株的雄性能夠正常繁殖，但能力略低于雄株；兩性植株的雌性也能夠正常繁殖，且能力略高于雌株?？傮w而言，兩性植株的雄性和雌性都可以成功的繁殖后代，繁殖能力較之雄株和雌株雖有一定的差異，但基本處于同一水平。兩性植株也能夠通過自交成功繁殖后代，其繁殖能力與異交相比處于同一水平上，不存在自交不親和現(xiàn)象，單株即可完成繁殖任務。為以后黃檗乃至植物性別相關研究提供了基礎，也為黃檗野生資源保護帶來了希望，但黃檗性別形成與分化機制以及兩性黃檗植株在野外情況還需要進一步的研究和調查。