高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分離及其降解特性

劉慶輝,李 劍,楊 航,王志宇,李 艷,張瑋川,賈銀娟,張秋根,羅旭彪

高效苯酚降解菌sp. L5-1的分離及其降解特性

劉慶輝,李 劍*,楊 航,王志宇,李 艷,張瑋川,賈銀娟,張秋根,羅旭彪

(南昌航空大學(xué),重金屬污染物控制與資源化國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,江西 南昌 330063)

從污水處理廠活性污泥中分離篩選出一株高效苯酚降解菌L5-1,經(jīng)菌落形態(tài)觀察和16S rDNA基因測(cè)序,結(jié)果表明菌株L5-1為蠟樣芽胞桿菌(),美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)的注冊(cè)號(hào)為MN784421.將苯酚設(shè)置為唯一碳源,對(duì)其生長(zhǎng)和苯酚降解特性展開研究.結(jié)果表明: 菌株L5-1在10%接種量、溫度30～35℃、pH值7～8的條件下,均能高效降解培養(yǎng)基中苯酚(培養(yǎng)基體積為100mL,初始苯酚濃度為500mg/L,14h時(shí)降解率>93%).而在最優(yōu)降解條件下(10%接種量,培養(yǎng)溫度為35℃,pH值7.0,NaCl濃度為1%),初始苯酚濃度為500mg/L,菌株在14h內(nèi)的苯酚降解率可達(dá)97.1%;而當(dāng)初始苯酚濃度為1000mg/L,菌株也可在46h內(nèi)達(dá)到97.71%的降解率.運(yùn)用Haldance方程動(dòng)力學(xué)模擬菌株在不同濃度苯酚下的生長(zhǎng)過(guò)程,其最大比生長(zhǎng)速率為0.355h-1,半飽合常數(shù)104.27mg/L,抑制常數(shù)為322.83mg/L,2=0.997.菌株L5-1為目前已報(bào)道的菌屬中降解苯酚能力較強(qiáng)的菌株,為實(shí)際處理含酚廢水中提供理論參考.

；苯酚；生物降解；動(dòng)力學(xué)

苯酚污染廢水是一種典型的高毒性工業(yè)廢水,是紡織加工、煤炭氣化、石油精煉、皮革制造、樹脂合成、醫(yī)藥制造、香料生產(chǎn)、合成纖維等許多工業(yè)過(guò)程中常見的有機(jī)污染物[1].并且苯酚具有很強(qiáng)的流動(dòng)性,在濃度很低時(shí)(1mg/L)也能快速滲透到周圍生態(tài)環(huán)境中,導(dǎo)致水體有難聞的氣味和味道,對(duì)動(dòng)植物有長(zhǎng)效性和生物積累性[2].美國(guó)和中國(guó)也先后將苯酚列入首批水中優(yōu)先控制污染物名單[3].目前含酚廢水的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法.利用生物法替代物理化學(xué)法礦化廢水中的苯酚具有成本低、效率高等特點(diǎn),且降解后的最終產(chǎn)物多為環(huán)境無(wú)害物質(zhì),如低碳化合物,二氧化碳和水[4-5].因此,利用生物法處理含酚廢水受到廣泛關(guān)注.

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者就如何利用微生物降解苯酚污染廢水進(jìn)行了大量的研究, 篩選出多種菌株,有根瘤菌()[6]、不動(dòng)桿菌如[7]和sp.AQ5NOL 1[8]、紅球菌如[9]和spp.CM-HZX1[10]、產(chǎn)堿桿菌(sp.)[11]等.其中有許多能降解高濃度苯酚并具有良好耐受性的微生物,如Jiang等[12]從湖北某藥廠的生物池中分離出genus,能在72h內(nèi)降解800mg/L苯酚.陳曉華等[13]從北京一處人工濕地分離出的sp.可耐受1300mg/L苯酚并在48h內(nèi)對(duì)1000mg/L苯酚降解率達(dá)到82.2%,王圖錦等[14]從一個(gè)焦化廠受污染的土壤中分離出不動(dòng)桿菌,能在60h內(nèi)完全降解初始濃度1200mg/L苯酚. Shourian等[15]從制藥處理廢水中分離出的sp.能在85h內(nèi)降解1000mg/L苯酚.在目前發(fā)現(xiàn)的眾多苯酚降解菌中,有不少研究報(bào)道菌屬能有效降解苯酚.J20 在120h內(nèi)對(duì)700mg/L的苯酚降解率為88.6%[16],降解1000mg/L苯酚需132h[17].其中降解廢水中苯酚的研究較少,苯酚降解效率也較低,菌株F6在8h內(nèi)僅能降解100mg/L苯酚[18],B3降解800mg/L的苯酚需72h[19].

本文取江西南昌象湖污水處理廠的曝氣池活性污泥,在實(shí)驗(yàn)室模擬工業(yè)含酚廢水逐步馴化苯酚降解菌,篩選出一株對(duì)高濃度苯酚耐受并且降解效果優(yōu)異的菌株L5-1,探討了培養(yǎng)條件(接種量、溫度、pH值、鹽度、初始苯酚濃度)對(duì)L5-1生長(zhǎng)及苯酚降解的影響.并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Haldance方程動(dòng)力學(xué)模型相擬合,探究了菌株生長(zhǎng)和初始苯酚濃度之間的關(guān)系,以期為微生物處理苯酚污染廢水提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 菌種的來(lái)源

本研究用來(lái)分離篩選菌株的樣品取自江西南昌象湖污水廠曝氣池活性污泥(黑色絮狀).

1.2 培養(yǎng)基的制備

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L):NH4NO31.50,KH2PO41.50, K2HPO41.2, NaCl 5.00, MgSO40.06, MnSO40.02, H3BO30.02,ZnSO4.7H2O 0.03, FeSO40.05,通過(guò)1mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH值.定容至指定體積后滅菌備用.

富集培養(yǎng)基(g/L):牛肉浸膏4,蛋白胨8,NaCl 4.定容至指定體積后滅菌備用.

固體培養(yǎng)基:在已配好的液體培養(yǎng)基中加入1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉制成固體培養(yǎng)基,經(jīng)高壓滅菌鍋中滅菌后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿冷卻備用.

1.3 菌種的富集與馴化

將適量活性污泥加入到100mL無(wú)菌生理鹽水中,在30℃,150r/min下充分振蕩1h,取10%體積的菌液,在無(wú)菌環(huán)境下接種到滅菌后的富集培養(yǎng)基中.在30℃,150r/min下培養(yǎng)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后,取10mL富集菌液接種到90mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,并添加苯酚作為唯一碳源.在同樣的培養(yǎng)條件下重復(fù)此操作,以100mg/L為增加量逐步提升苯酚濃度至1000mg/L. 選擇生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

1.4 苯酚降解菌的篩選與純化

用無(wú)菌水將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液稀釋成不同濃度梯度.在無(wú)菌環(huán)境下均勻地涂布在固體培養(yǎng)基表面.在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),定時(shí)觀察,挑取形態(tài)及大小、顏色不同的單一菌落,于事先配置好的300mg/L苯酚的固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上劃線,得到單一純菌.將分離的單一純菌富集培養(yǎng)至OD600為1.0左右,作為接種體備用.以10%(體積比)的接種量加入到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,添加苯酚作為唯一碳源.在30℃、150r/min,以相同條件下沒有加入菌液但添加了相同濃度苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照組,通過(guò)定時(shí)檢測(cè)各培養(yǎng)基的苯酚濃度選擇出降解效果最好的菌株,最后再反復(fù)劃線確保得到單株菌種.并用斜面低溫保存.

1.5 菌株生長(zhǎng)和苯酚降解率的測(cè)定

細(xì)菌生長(zhǎng)量的測(cè)定:采用不含菌液的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照參比,在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定菌種吸光值(OD600).代入公式(1)計(jì)算菌體質(zhì)量濃度(DCW)[19].

苯酚濃度采用4-氨基替比林法測(cè)定苯酚濃度[20],代入公式(2)計(jì)算培養(yǎng)基苯酚降解率

1.6 菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

1.6.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 將菌株接種于固體培養(yǎng)基中觀察其菌落形態(tài),采用掃描電鏡(SU1510)在10000倍下觀察菌株L5-1的表面形態(tài).測(cè)定菌株革蘭氏染色、好氧性等生理生化指標(biāo).

1.6.2 16S rDNA序列分析 將要鑒定的菌株在固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,用試劑盒(上海生工)提取分離出菌株L5-1的基因組DNA,采用細(xì)菌通用引物27F 和反向引物1492R 擴(kuò)增反應(yīng)DNA序列[21].將產(chǎn)物電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序分析(上海生工).測(cè)序結(jié)果在BLAST和MEGA4.1軟件中進(jìn)行基因庫(kù)比對(duì)分析和以鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,初步獲得菌株的生物學(xué)分類地位.

1.7 菌株生長(zhǎng)及降解苯酚特性

以不同體積比的接種量(6%、8%、10%、12%、14%)、不同培養(yǎng)溫度(15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃)、不同pH值(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、不同NaCl濃度(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)在體積為100mL,初始苯酚濃度為500mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行單因素試驗(yàn),在150r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 間隔1h取一次樣,測(cè)定培養(yǎng)基中生物量和苯酚降解率,確認(rèn)其最適宜的苯酚降解條件.

菌株在不同初始苯酚濃度下的降解:根據(jù)以上試驗(yàn)確定的最佳接種量、溫度、pH值以及NaCl濃度接種于不同初始苯酚濃度(200～1400mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在150r/min的培養(yǎng)箱中間隔2h取一次樣,測(cè)定培養(yǎng)基中的生物量和苯酚含量.以上試驗(yàn)均重復(fù)3次.

1.8 苯酚降解動(dòng)力學(xué)分析

在微生物降解苯酚的過(guò)程中,降解底物苯酚既作為微生物的唯一碳源,又因?yàn)槠涠拘詴?huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[22].因此本研究采用Haldane方程來(lái)描述初始苯酚濃度對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)的影響[23], 如公式(3)所示

式中:為微生物比生長(zhǎng)速率, h-1;max為最大比生長(zhǎng)速率, h-1;phenol為苯酚質(zhì)量濃度, mg/L;s為半飽和常數(shù), mg/L;K為抑制常數(shù), mg/L.并用Origin8.0將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與動(dòng)力學(xué)方程擬合.

2 結(jié)果與討論

2.1 苯酚降解菌的篩選與鑒定

圖1 菌株L5-1的掃描電鏡圖

圖2 菌株L5-1的16S rDNA序列進(jìn)化樹

通過(guò)多次富集馴化和分離純化后,本研究得到4株對(duì)高濃度苯酚具有較高降解效果且能夠良好生長(zhǎng)的菌株,其中一株菌株具有良好的苯酚耐受性以及高效的苯酚降解率,將該菌株命名為L(zhǎng)5-1,觀察其菌落形態(tài)和部分生理生化特征,結(jié)合16S rDNA鑒定其菌種.經(jīng)觀測(cè),L5-1菌落形態(tài)為白色,圓形,不透明,表面粗糙.革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陽(yáng)性菌.進(jìn)行瓊脂柱穿刺實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其為兼性好氧菌.掃描電鏡(10000×)結(jié)果如圖1所示,可以看出菌體為桿狀,表面較為平整,不透明,大小在1.5～2mm左右,且生長(zhǎng)狀況良好.

測(cè)定16Sr DNA核酸序列,并將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中作比對(duì)分析,構(gòu)建了菌株L5-1與其他相近菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(圖2).結(jié)果顯示菌株L5-1與蠟樣芽孢桿菌(. MH19)相似性為99.6%,根據(jù)同源性分析結(jié)果,該菌株歸屬于sp.,鑒定結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌().該菌株的基因序列已提交至NCBI基因庫(kù),其注冊(cè)號(hào)為MN784421.

2.2 接種量對(duì)菌株L5-1降解苯酚的影響

圖3 不同接種量對(duì)菌株L5-1降解苯酚的影響

接種量的多少會(huì)對(duì)菌株降解苯酚產(chǎn)生直接影響,接種量過(guò)少會(huì)導(dǎo)致菌株更容易受到苯酚的抑制作用,接種量過(guò)高則會(huì)增加投入成本,會(huì)造成菌株之間對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng),影響降解效果.如圖3所示,接種量為6%菌液時(shí),培養(yǎng)基中菌株在14h內(nèi)對(duì)500mg/L苯酚的降解率為74.4%,菌株降解苯酚的停滯期隨著接種量的增高而明顯縮短,培養(yǎng)基中苯酚的濃度也在不斷降低,接種量為10%、12%時(shí),在14h內(nèi)培養(yǎng)基中濃度為500mg/L的苯酚均被完全降解,接種量為14%時(shí),在14h內(nèi)培養(yǎng)基中苯酚降解率為96.8%.說(shuō)明適當(dāng)?shù)奶岣呓臃N量是提升菌株降解苯酚效果的一種有效途徑.可以看出接種量超過(guò)10%時(shí)菌株對(duì)苯酚的降解效果提升不明顯,接種量過(guò)大時(shí)反而影響到菌株的降解效果,且會(huì)增加經(jīng)濟(jì)成本,綜合考慮選擇10%作為菌株L5-1的最佳接種量.

2.3 溫度對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)和降解苯酚的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素,選擇出合適的溫度能有效提高微生物酶活性,有助于提升參與苯酚降解的酶促反應(yīng)速率[23].從圖4中可以看出,菌株L5-1的最佳生長(zhǎng)和降解苯酚溫度為35℃,并在30～35℃之間對(duì)500mg/L苯酚在14h的降解率都大于95%(30℃為95.4%,35℃為96.9%),且生長(zhǎng)狀況良好.該菌株具有典型的嗜中溫特點(diǎn),培養(yǎng)溫度在15和45℃時(shí)生物量和降解率都達(dá)到最低(15℃時(shí)降解率19.7%,45℃時(shí)降解率24.6%).這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)溫度過(guò)低會(huì)使參與酚類降解的微生物酶活性降低,細(xì)菌新陳代謝速率變慢,溫度過(guò)高則容易讓微生物酶失去活性[24].

圖4 溫度對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)及苯酚降解的影響

初始苯酚濃度500mg/L,14h

2.4 pH值對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)和降解苯酚的影響

如圖5所示,菌株L5-1的最佳生長(zhǎng)和降解苯酚pH值為7.0,14h內(nèi)對(duì)500mg/L苯酚降解率為97%,培養(yǎng)基中pH值低于7.0后,隨著pH值的下降菌株對(duì)苯酚的降解率逐漸下降,當(dāng)培養(yǎng)基中pH值為4.0時(shí),菌株基本不生長(zhǎng).當(dāng)pH值超過(guò)7.0后,菌株在堿性條件下對(duì)苯酚的降解率和生長(zhǎng)狀況相比酸性條件下有明顯提高(pH值為5.0時(shí)31.3%,pH值為6.0時(shí)70.6%,pH值為8.0時(shí)93.4%,pH值為9.0時(shí)61.7%,pH值為10.0時(shí)7.8%).這是因?yàn)楸椒釉诮到膺^(guò)程中會(huì)產(chǎn)如己二酸、丙酮酸等有機(jī)酸,致使培養(yǎng)基的pH值逐漸降低,所以中性和偏堿性環(huán)境相比酸性環(huán)境更有利于菌株降解苯酚[25-26].并且在偏酸和偏堿的條件下,菌株L5-1的生長(zhǎng)和苯酚降解效率都明顯下降.這可能由于pH值影響到了微生物的生長(zhǎng)和代謝,進(jìn)而影響到微生物對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和苯酚的降解[27].在pH值為6.0～9.0條件下,菌株L5-1在14h內(nèi)對(duì)苯酚的降解率都大于60%,表面菌株L5-1對(duì)pH值有良好的耐受范圍且該菌株更耐堿性環(huán)境.

圖5 pH值對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)及苯酚降解的影響

初始苯酚濃度500mg/L,14h

2.5 NaCl對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)和降解苯酚的影響

在工業(yè)廢水的排放過(guò)程中,除了高濃度含酚污染物之外,通常還含有大量鹽分,過(guò)高的鹽分會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)且對(duì)微生物有一定的毒害作用[28].如圖6所示,菌株最適宜NaCl濃度為1%.當(dāng)NaCl濃度在2%～6%范圍內(nèi)時(shí),菌株L5-1和苯酚降解率在68h內(nèi)對(duì)500mg/L苯酚降解率都為97%左右,當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度超過(guò)6%時(shí),菌株的生長(zhǎng)和苯酚降解隨著NaCl濃度的升高而明顯受到抑制.當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度增加至10%時(shí),菌株L5-1的生長(zhǎng)量和苯酚降解率仍達(dá)到0.58和62.7%,表明菌株對(duì)鹽濃度有很好的耐受性.王麗娟等[29]發(fā)現(xiàn)sp.CCZU-R6在5%的鹽度下降解500mg/L苯酚,72h時(shí)內(nèi)降解率僅在50%左右,在8%的鹽度下降解500mg/L苯酚,72h時(shí)降解率僅在20%左右.黃中子等[30]發(fā)現(xiàn)一株sp.在5%的鹽度下降解500mg/L苯酚,72h內(nèi)的去除率達(dá)98%.因此,菌株L5-1與現(xiàn)有的菌株相比具有較寬的鹽濃度適應(yīng)范圍和較快的降解速率,在處理含鹽苯酚廢水中有一定的優(yōu)勢(shì).

圖6 NaCl濃度對(duì)菌株L5-1生長(zhǎng)及苯酚降解的影響

初始苯酚濃度500mg/L,68h

2.6 菌株生長(zhǎng)與苯酚的降解

菌株L5-1在最佳降解條件下(10%的接種量、溫度為35℃、pH值為7.0、NaCl濃度為1%)接種至初始苯酚濃度為500mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,其隨時(shí)間的生長(zhǎng)與苯酚降解曲線如圖7所示.

圖7 最佳條件下菌株L5-1的生長(zhǎng)及苯酚降解曲線

由圖7可知,L5-1經(jīng)歷了近4h的停滯期,在此期間苯酚濃度下降緩慢,5～9h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)極其迅速,苯酚含量隨著細(xì)菌數(shù)量的增加而迅速下降,并在接種13h后達(dá)到靜止期,此時(shí)培養(yǎng)基中細(xì)菌總數(shù)達(dá)到最大,其OD600值為0.93.到14h時(shí),對(duì)500mg/L苯酚的降解率達(dá)到97.1%.

2.7 初始苯酚濃度對(duì)降解率的影響

菌株在不同初始苯酚濃度下,苯酚濃度隨時(shí)間降解效果如圖8所示.當(dāng)初始苯酚濃度為200mg/L時(shí),在6h內(nèi)苯酚降解率達(dá)到89%.46h對(duì)1000mg/L苯酚的降解率達(dá)到97.71%.隨著初始苯酚濃度的提高,菌株的停滯期也相應(yīng)的增加,菌株降解相同含量的苯酚所需的時(shí)間逐漸延長(zhǎng).當(dāng)初始苯酚濃度為1200mg/L時(shí),66h才將培養(yǎng)基中苯酚濃度降解到32mg/L左右,降解率為97.4%.而當(dāng)初始苯酚濃度為1400mg/L時(shí),苯酚66h內(nèi)的降解率僅為29.0%,由此可見,高濃度苯酚對(duì)菌株L5-1的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制或毒害作用,使得菌株降解苯酚速率變得尤為緩慢.

圖8 不同初始苯酚濃度對(duì)菌株L5-1降解苯酚的影響

2.8 菌株L5-1對(duì)苯酚的降解動(dòng)力學(xué)研究

將微生物比生長(zhǎng)速率和苯酚初始質(zhì)量濃度通過(guò)非線性最小二乘法按照方程擬合(圖9),方程動(dòng)力學(xué)參數(shù)為:max=0.355h-1,s=104.27mg/L,K為322.83mg/L,降解苯酚最適濃度為183.78mg/L.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型擬合吻合良好,相關(guān)系數(shù)2為0.997.結(jié)果表明,苯酚是一種抑制底物,初始苯酚濃度低于183.78mg/L時(shí),菌株L5-1的比生長(zhǎng)速率與初始苯酚濃度成正比關(guān)系,這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中降解菌缺乏足夠的碳源供其生長(zhǎng),此時(shí)培養(yǎng)基中底物的濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)速率起主導(dǎo)作用.初始苯酚濃度高于183.78mg/L時(shí),菌株L5-1的比生長(zhǎng)速率成負(fù)相關(guān),此時(shí)初始苯酚濃度的升高使其對(duì)菌株抑制作用逐漸增強(qiáng).

表1中為目前已報(bào)道的幾種微生物苯酚降解動(dòng)力學(xué)參數(shù),其中max表示最大比生長(zhǎng)速率,s飽和常數(shù)大小表示菌株對(duì)苯酚的親和性,s越小表示菌株對(duì)苯酚的親和性越大,菌株的比生長(zhǎng)速率也就更快, K抑制常數(shù)則表示苯酚對(duì)菌株的抑制強(qiáng)度和毒害大小, K值越大,苯酚對(duì)菌株的抑制和毒害作用也就越小,菌株耐受苯酚程度就越大[22].由表可以看出,菌株L5-1比較于其它苯酚降解菌的最大比生長(zhǎng)速率和飽和常數(shù)相差不大,屬于一般水平,其抑制常數(shù)大于sp.CH10[13]、波茨坦短芽孢桿菌[22]和n.sp[31]等其它苯酚降解菌,說(shuō)明菌株L5-1具有良好的苯酚耐受能力.

表1 不同微生物的苯酚降解動(dòng)力學(xué)Haldhance方程參數(shù)

圖9 菌株L5-1苯酚降解動(dòng)力學(xué)

3 結(jié)論

3.1 從污水處理廠活性污泥中分離出一株苯酚降解菌.鑒定分析為芽孢桿菌屬(sp.),命名為L(zhǎng)5-1.該菌株對(duì)苯酚具有高效的降解能力.其中最佳降解條件是接種量為10%,生長(zhǎng)溫度為35℃,pH值7.0,NaCl濃度為1%.

3.2 菌株降解不同初始濃度苯酚動(dòng)力學(xué)與Haldance模型吻合良好,經(jīng)擬合其生長(zhǎng)參數(shù)為max= 0.355h-1,s=104.27mg/L,K=322.83mg/L.相關(guān)性系數(shù)(2)為0.997.

3.3 該菌株相比于其他降酚菌株具有較寬的環(huán)境適應(yīng)范圍和更高的降解效率,14h對(duì)500mg/L苯酚的降解率達(dá)到97.71%,46h對(duì)1000mg/L苯酚的降解率達(dá)到97.7%.因此,該菌株在含酚廢水的生物降解領(lǐng)域有極大的應(yīng)用潛力.

[1] Mao Z, Yu C, Xin L. Enhancement of phenol biodegradation bysp. through ultraviolet-induced mutation [J]. International Journal of Molecular Sciences. 2015,16(12):7320-7333.

[2] Massalha N, Shaviv A, Sabbah I. Modeling the effect of immobilization of microorganisms on the rate of biodegradation of phenol under inhibitory conditions [J]. Water Research, 2010,44(18): 5252-5259.

[3] 王 兵,劉璞真,任宏洋,等.非均相催化臭氧化降解水中苯酚動(dòng)力學(xué)[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2016,10(7):3427-3433. Wang B, Liu P Z, Ren H Y, et al. Degradation kinetics of catalytic ozone oxidation of phenol in water [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering. 2016,10(7):3427-3433.

[4] 陳治希,劉昭文,楊 凱,等.微生物降解酚類污染物的研究進(jìn)展[J]. 廣州化學(xué), 2015,40(1):72-78. Chen Z X, Liu Z W, Yang K, et al. Progress of phenolic compounds degradation by microbes [J].Guangzhou Chemistry, 2015,40(1):72-78.

[5] Lu Z, Guo X, Li H, et al. High-throughput screening for a moderately halophilic phenol-degrading strain and its salt tolerance response [J]. International Journal of Molecular Sciences. 2015,16(12):11834- 11848.

[6] Wei G H, Yu J F, Zhu Y H, et al. Characterization of phenol degradation bysp. CCNWTB 701isolated from Astragalus chrysopteru in mining tailing region [J]. Journal of Hazardous Materials, 2008,151(1):111-117.

[7] 陳 明,張 維,徐玉泉,等.醋酸鈣不動(dòng)桿菌PHEA-2對(duì)苯酚的降解特性研究[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2001,21(3):226-229. Chen M, Zhang W, Xu Y Q, et al. Study on characteristics ofPHEA-2 for phenol degradation [J]. China Environmental Science, 2001,21(3):226-229.

[8] Ahmad S A, Shamaan N A, Arif N M, et al. Enhanced phenol degradation by immobilizedsp. strain AQ5NOL 1[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012,28(1): 347-352.

[9] 劉艷霞.降酚菌的定向馴化及其對(duì)含酚廢水的降解作用[D]. 北京:北京化工大學(xué), 2011. Liu Y X. The teaming of phenol-degraded bacteria and its biodegradability to phenolic wasterwater [D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2011.

[10] 魏 霞,周俊利,謝 柳,等.苯酚降解菌CM-HZX1菌株的分離、鑒定及降解性能研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016,36(9):3193-3199. Wei X, Zhou J L, Xie L, et al. Isolation, identification and characterization of phenol-degrading strain CM-HZX1 [J]. Acta Scientiae Circumstantiae. 2016,36(9):3193-3199.

[11] 徐 慶.苯系物降解菌的篩選及其降解特性研究[D]. 曲阜:曲阜師范大學(xué), 2017. Xu Q, Screening of benzene series degradation bacteria and study on their degradation characteristics [D]. Qufu: Qufu Normal University.

[12] Jiang Y, Yang K, Wang H, et al. Characteristics of phenol degradation in saline conditions of a halophilic strain JS3 isolated from industrial activated sludge [J]. Marine Pollution Bulletin, 2015,99(1/2):230-234.

[13] 陳曉華,魏 剛,劉思遠(yuǎn),等.高效降酚菌株sp. CH10生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和苯酚降解特性的研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2012,33(11):3956- 3961. Xu X H, Wei G, Liu S Y, et al. Growth kinetics and phenol degradation of highly efficient phenol-degradingsp. CH10 [J]. Environmental Science, 2012,33(11):3956-3961.

[14] 王圖錦,潘 瑾,劉雪蓮.高效苯酚降解菌PDB1的篩選及降解特性研究 [J]. 科學(xué)技術(shù)與工程, 2017,17(2):301-304. Wang T J, Pan J, Liu X L, et al. Breeding of Phenol-degradation Bacteria and Studyon Phenol Biodegradation by the Strain PDB1[J]. Science Technology and Engineering, 2017,17(2):301-304.

[15] Shourian M, Noghabi K A, Zahiri H S, et al. Efficient phenol degradation by a newly characterizedsp. SA01 isolated from pharmaceutical wastewaters [J]. Desalination, 2009,246(1-3): 577-594.

[16] Ereqat S I, Abdelkader A A, Nasereddin A F, et al. Isolation and characterization of phenol degrading bacterium strainJ20 from olive waste in Palestine [J]. Journal of Environmental Science and Health, Part A. 2018,53(1):39-45.

[17] Arutchelvan V, Kanakasabai V, Elangovan R, et al. Kinetics of high strength phenol degradation using[J]. Journal of Hazardous Materials. 2006,129(1-3):216-222.

[18] 劉鴻杰,何熙璞,李 浩,等.苯酚降解菌F6的篩選鑒定及降解特性[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2017,36(1):233-238. Liu H J, He X P, Li H, et al. Isolation and identification of phenol degradation strain F6 and its degradation characteristic [J]. Genomics and Applied Biology, 2017,36(1):233-238.

[19] 于彩虹,陳 飛,胡琳娜,等.一株苯酚降解菌的篩選及降解動(dòng)力學(xué)特性[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2014,8(3):1215-1220. Yu C H, Chen F, Hu L N, et al. Selection of phenol degradation bacteria and characteristic of degradation kinetics [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2014,8(3):1215-1220.

[20] HJ 503-2009 水質(zhì)水中揮發(fā)酚類測(cè)定4-氨基安替比林分光光度法[S]. HJ 503-2009 Water quality-ddetrmination of volatile phenolic compounds-4-AAP spectrophotometric method [S].

[21] 馮玉雪,毛 縝,呂蒙蒙.一株DDT降解菌的篩選及其降解特性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2018,38(5):1935-1942. Feng Y X, Mao Z, Lv M M. Screening and degradation characteristics of a DDT-degrading bacteria [J]. China Environmental Science, 2018,38(5):1935-1942.

[22] 葛啟隆,王國(guó)英,岳秀萍.波茨坦短芽孢桿菌降解苯酚特性及動(dòng)力學(xué)研究 [J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2014,(3):117-122. Ge Q L, Wang G Y, Yue X P. Phenol degradation byand kinetic analysis [J]. Biotechnology Bulletin, 2014, (3):117-122.

[23] 趙娜娜,許繼飛,宋曉雪,等.嗜鹽高效降酚菌株sp. H17的篩選及降解苯酚特性 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2019,39(2):318-324. Zhao N N, Xu J F, Song X X, et al. Screening and phenol-degrading characteristics of a highly efficient phenoldegrading halophilic bacterial strainsp.H17 [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2019,39(2):318-324.

[24] Levén L, Nyberg K, Schnürer A. Conversion of phenols during anaerobic digestion of organic solid waste – A review of important microorganisms and impact of temperature [J]. Journal of Environmental Management, 2012,95(1):S99-S103.

[25] Kuang Y, Zhou Y, Chen Z L, et al. Impact of Fe and Ni/Fe nanoparticles on biodegradation of phenol by the strain Bacillus fusiformis (BFN) at various pH values [J]. Bioresource Technology, 2013,136(Complete):588-594.

[26] 張安龍,王 曄,王雪青,等.一株高效苯酚降解真菌的分離鑒定及其菌劑的制備 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2018,45(7):1450-1461. Zhang A L, Wang Y, Wang X Q, et al. Isolation and identification of a high-efficiency phenol-degrading fungi and the preparation of its microbial inoculum [J]. Microbiology China, 2018,45(7):1450-1461.

[27] 張立國(guó),劉建忠,班巧英,等.弱酸性條件下丙酸富集培養(yǎng)物的降解特性[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2016,36(12):3724-3728. Zhang L G, Liu J Z, Ban Q Y, et al. Degradation characteristics of a propionate enriched culture at slightly acidic conditions [J]. China Environmental Science, 2016,36(12):3724-3728.

[28] Li H, Meng F, Duan W, et al. Biodegradation of phenol in saline or hypersaline environments by bacteria: A review [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019,184:109658.

[29] 王麗娟,錢子雯,沈海波,等.一株耐鹽菌的分離及其降解特性[J]. 化工進(jìn)展, 2017,36(3):1047-1051. Wang L J, Qian Z W, Shen H B, et al. Separation and biodegradation characteristics of a halotolerant strain [J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2017,36(3):1047-1051.

[30] 黃中子,李 輝,劉勇弟,等.一株中度嗜鹽菌sp.PDB-F2對(duì)苯酚的降解特性[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2015,38(12):1-5. Huang Z Z, Li H, Liu Y D, et al. Characteristics of phenol biodegradation by a moderately halophilic bacteriumsp. PDB-F2 [J]. Environmental Science & Technology, 2015,38(12):1-5.

[31] 馬溪平,艾 嬌,徐成斌,等.耐低溫苯酚降解菌的降解動(dòng)力學(xué)研究[J]. 環(huán)境保護(hù)科學(xué), 2009,35(5):18-21. Ma X P, Ai J, Xu C B, et al. Study on kinetics of phenol biodegradation by low temperature- resistance strain [J]. Environmental Protection Science, 2009,35(5):18-21.

[32] Jiang Y, Wen J, Bai J, et al. Biodegradation of phenol at high initial concentration by[J]. Journal of Hazardous Materials, 2007,147(1/2):672-676.

Isolation and degradation characteristics of highly efficient phenol-degrading bacteriasp. L5-1.

LIU Qing-hui, LI Jian*, YANG Hang, WANG Zhi-yu, LI Yan, ZHANG Wei-chuan, JIA Yin-juan, ZHANG Qiu-gen, LUO Xu-biao

(National-Local Joint Engineering Research Center of Heavy Metals Pollutants Control and Resource Utilization, Nanchang Hangkong University, Nanchang 330063, China)., 2021,41(5)：2441～2448

A highly efficient phenol-degrading bacterium named L5-1 was isolated and screened from the activated sludge from a sewage treatment plant. The colony morphology observation and 16S rDNA gene sequencing showed that the strain L5-1 was, with the registration number of MN784421 in the US National Center for Biotechnology Information (NCBI). A series of experiments with Phenol as the only carbon source were conducted to study the growth and phenol degradation characteristics of this strain L5-1. The results showed that underthe conditions of 10% inoculum, temperature range of 30 to 35℃, pH range of 7 to 8, the strain L5-1 effectively degraded phenol in the culture medium (with the 100mL of medium volume and the initial phenol concentration of 500mg/L), the degradation rate wasbetter than 93% in 14h.Under optimal degradation conditions (10% inoculum, culture temperature at 35℃, pH 7.0, and NaCl concentration at 1%), The phenol degradation rate reached97.1%within 14 hours when the initial concentration was set at 500mg/L. When the initial phenol concentration was set to 1000mg/L, the strainL5-1 still reached 97.71% degradation rate within 46 hours. The Haldane kinetic model was used to simulate the growth process of strains under different concentrations of phenol. The maximum specific growth rate was 0.355h-1, the semi-saturation constant was 104.27mg/L, the inhibition constant was 322.83mg/L,2=0.997. This study confirmed Strain L5-1 was astrainswith strong phenol degradation ability among the reported strains of the genus, and provided certain theoretical references for the actual treatment of phenol-containing wastewater.

；phenol；biodegradable；kinetics

X172

A

1000-6923(2021)05-2441-08

劉慶輝(1998-),男,江西吉安人,南昌航空大學(xué)碩士研究生,主要從事?lián)]發(fā)性有機(jī)物的生物降解研究.

2020-09-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21467018);江西省教育廳項(xiàng)目(GJJ170576);江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20181ACG70021)

* 責(zé)任作者, 副教授, lijian@nchu.edu.cn