劉曉曉，潘玉朋，劉 策，丁圓圓，王曦奧，程智慧，孟煥文

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100)

黃瓜(CucumissativusL.，2n=2x=14)是葫蘆科1年生蔓性草本植物，起源于印度西北部喜馬拉雅山脈南麓[1]，在我國已有2 000多年的栽培史[2]。黃瓜是世界十大蔬菜之一[3]，不僅在我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位，在全球范圍的消費需求和栽培面積也位居前列。黃瓜果型包括果實大小和形狀，由于消費習慣或加工需求的不同，不同果型的黃瓜被不同的消費市場所青睞，故果型是黃瓜遺傳改良育種的重要品質和產(chǎn)量性狀。

黃瓜果型在其子房期即表現(xiàn)出豐富的多樣性，不同黃瓜種質間的果型差異極大，如果實小且呈卵圓形的野生種質、果實形態(tài)各異的半野生種質，以及適于不同消費類型的栽培品種。果型由細胞數(shù)目和細胞大小共同決定[4]。每個細胞都是激素活動的產(chǎn)物，所有的活細胞都對激素的作用有響應[5]，已有研究表明，植物內(nèi)源激素參與了細胞分裂和細胞膨大的調控，與果實發(fā)育有著密切的關系[6]。然而，對黃瓜果型在組織以及內(nèi)源激素水平上的差異內(nèi)因尚不明了。有研究指出，子房期的黃瓜果實長度和果形指數(shù)分別與成熟果實的長度和果形指數(shù)有極顯著正相關性，即可用子房期的黃瓜果型來預測黃瓜最終的果型[7]。因此，本研究擬對不同果型黃瓜的子房進行組織學觀察和內(nèi)源激素含量測定，從而在組織學水平和激素水平上揭示黃瓜果型差異的機制，以期為后續(xù)深入闡明黃瓜果型建成的內(nèi)在調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以12個果實大小和形狀差異較大的黃瓜自交系作為試驗材料(表1，圖1)，材料均由威斯康辛大學Weng Yiqun教授提供。

表1 供試黃瓜材料信息Table 1 Information of tested cucumbers

于2019年春季種植于西北農(nóng)林科技大學園藝場的塑料拱棚中，生長期間進行常規(guī)管理。進入開花期后，于每天上午09:00-11:00，在主蔓10～15節(jié)取開花當天(開花的第1天)的雌花子房用于后續(xù)試驗。

圖中各材料信息與表1同。下圖同The material information is the same as Table 1,the same below圖1 不同果型黃瓜開花當天的子房Fig.1 Cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis

1.2 試驗方法

1.2.1 子房形態(tài)學指標測定 采集開花當天的子房，測量子房長度、子房橫徑和種腔橫徑，計算子房形狀指數(shù)(子房形狀指數(shù)=子房長度/子房橫徑)，測量標準參照李錫香[8]的方法，每個自交系測量6個子房，結果取平均值。

1.2.2 子房細胞數(shù)目和細胞面積測定 采集開花當天的子房，每個自交系采集6個子房，其中3個用作縱切面觀察，另外3個用作橫切面觀察，用銳刀切取子房中部并立即放入FAA固定液(V(體積分數(shù)70%酒精)∶V(甲醛)∶V(乙酸)=90∶5∶5)。石蠟切片的制作參照李正理[9]的方法，通過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、旋轉切片機切片(Leica RT2235)、脫蠟、甲苯胺藍染色等步驟，于Olympus BX51顯微鏡下觀察并拍照。每個樣本隨機選擇3個視野，統(tǒng)計視野中所有細胞數(shù)目N和細胞總面積S，子房橫切面面積S′=總橫切面面積-橫切面種腔面積(以圓的面積公式計算)，子房縱切面面積S′=總縱切面面積-縱切面種腔面積(以長方形的面積公式計算)，子房縱、橫切面的細胞數(shù)目N′計算公式為：N′=NS′/S，平均細胞面積為：A=S/N，最后取平均值。在每樣本的中果皮部位選取500 μm×500 μm區(qū)域，對該區(qū)域的細胞進行計數(shù)，即為細胞密度，最后取平均值。細胞數(shù)目、細胞面積統(tǒng)計應用Fiji軟件(https://imagej.net/Fiji)完成。

1.2.3 子房內(nèi)源激素含量測定 采集開花當天的子房，摘取3～5個子房作為1個生物學重復，每個自交系設3個生物學重復，采摘后立即放入液氮速凍并放置于-80 ℃冰箱保存。內(nèi)源激素生長素(IAA)、玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(tZR)、赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的提取參照Pan等[10]的方法，將3～5個子房混合，全部用液氮研磨后稱取2 g樣品，然后加入20 mL提取劑(V(異丙醇)∶V(水)∶V(濃鹽酸)=2∶1∶0.002)，-20 ℃預冷，樣品與提取劑保持比例為1∶10(g/mL))，-20 ℃避光保存16 h；離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)后取全部上清，向裝有上清的離心管中加入30 mL二氯甲烷(V(提取劑)∶V(二氯甲烷)=1∶1.5)，搖床振蕩1 h(4 ℃，130 r/min)，離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)取出全部下相倒入蒸餾瓶中；旋轉蒸發(fā)儀濃縮(38 ℃，55 r/min)，樣品蒸干后，用1 mL色譜級甲醇溶解瓶內(nèi)物質，0.22 μm有機過濾頭過濾，最后用液質聯(lián)用儀LC-MS/MS(QTRAP 5500,AB Sciex)測定。由于AM66、SWCC8和XSBN3未達到檢測要求，所以只測了其他9個自交系的內(nèi)源激素。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖均在R軟件包(Version 3.6.3，https://www.r-project.org)中進行。相關性分析通過計算皮爾森相關系數(shù)(Pearson correlation coefficient)完成(https://cran.r-project.org/web/packages/psych/)，多個自交系之間利用Tukey’s test進行重復間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同果型黃瓜子房的形態(tài)學分析

由圖2可見，不同果型黃瓜開花當天的子房大小和形狀不同，一些自交系間的子房形態(tài)存在顯著差異，其中WI7237子房最長，子房形狀指數(shù)最大；而AM66、XSBN3、WI7120、True Lemon和WI7200的子房較短，子房果形指數(shù)較小。XSBN3、True Lemon和WI7204的子房橫徑較粗；XSBN3的種腔橫徑最大，True Lemon和WI7204次之。不同果型黃瓜自交系之間子房長度的長短規(guī)律與子房形狀指數(shù)基本一致，而子房橫徑與種腔橫徑的規(guī)律則相一致。

通過對子房大小性狀進行相關分析，計算各性狀間的皮爾森相關系數(shù)，結果表明，子房形狀指數(shù)與子房長度極顯著正相關(0.953 1，P<0.001)，與子房橫徑顯著負相關(-0.416 1，P<0.05)，說明二者均對黃瓜的果型形成具有重要作用。種腔橫徑與子房橫徑極顯著正相關(0.891 1，P<0.001)，說明種腔橫徑對子房橫徑有重要影響。

圖柱上標不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下圖同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),the same below圖2 不同果型黃瓜開花當天的子房形態(tài)指標Fig.2 Morphological index of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis

2.2 不同果型黃瓜子房的組織學分析

對不同果型黃瓜開花當天子房縱切面和橫切面的觀察結果見圖3和圖4。

圖3 不同果型黃瓜開花當天子房縱切面細胞(標尺=100 μm)Fig.3 Cell in longitudinal section of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis (bar=100 μm)

對不同果型黃瓜開花當天子房縱切面(圖3)和橫切面(圖4)的細胞數(shù)目、細胞面積、細胞密度進行分析發(fā)現(xiàn)，子房較長的NZ1、9930的縱切面細胞數(shù)目較多，子房較短的AM66、XSBN3、WI7120、True Lemon和WI7200的縱切面細胞數(shù)目較少(圖5-A)；XSBN3、True Lemon和SWCC8的橫切面細胞數(shù)目較多，AM66的橫切面細胞數(shù)目最少，其他自交系間均無明顯差異(圖5-B)。WI7204和AM66的縱、橫切面細胞面積均較大，Gy14的縱切面細胞面積較小，WI7120和SWCC8的橫切面細胞面積較小(圖5-C，D)。XSBN3的縱切面細胞密度較大，NZ1的較??；WI7120的橫切面細胞密度較大，WI7204的較小(圖5-E，F(xiàn))。綜合上述結果可知，不同果型黃瓜自交系之間子房縱切面細胞數(shù)目的變化規(guī)律與子房長度大致相同，子房橫切面細胞數(shù)目的多少則與子房橫徑變化規(guī)律相似。

圖4 不同果型黃瓜開花當天子房橫切面細胞(標尺=100 μm)Fig.4 Cell in cross section of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis (bar=100 μm)

由表2可知，不同果型黃瓜開花當天子房長度與橫徑無顯著相關性，子房縱切面細胞數(shù)目與橫切面細胞數(shù)目無顯著相關性，而子房縱切面細胞面積和橫切面細胞面積有極顯著正相關性。不同果型黃瓜開花當天子房縱切面細胞數(shù)目分別與子房長度和子房形狀指數(shù)有極顯著正相關性，子房橫切面細胞數(shù)目分別與子房橫徑和子房形狀指數(shù)有極顯著正相關性和顯著負相關性；而子房縱切面細胞面積和細胞密度與子房長度及子房形狀指數(shù)均無顯著相關性，子房橫切面細胞面積和細胞密度與子房橫徑及子房形狀指數(shù)均無顯著相關性。以上結果顯示，不同果型黃瓜子房長度和橫徑的差異主要是由細胞數(shù)目差異引起的，且子房長度和橫徑與子房形狀指數(shù)顯著相關，說明黃瓜果型的差異主要是由細胞數(shù)目不同所致。

表2 不同果型黃瓜開花當天子房大小與細胞數(shù)目、面積和密度間的相關性Table 2 Correlation among ovary size and cell number,area and density in cucumbers with different fruit sizes and shapes at anthesis

2.3 不同果型黃瓜子房的內(nèi)源激素含量比較

由表3可見，不同果型黃瓜開花當天子房中，WI7237的IAA含量較高，True Lemon較少，其他自交系間均無顯著差異；9930和WI7204的ZT含量較高，WI7120和WI7200較少，其他自交系間均無顯著差異；WI7200的tZR含量較高，WI7123和9930較少，其他自交系間均無顯著差異；WI7120的GA3含量最高，總體表現(xiàn)為子房較長的自交系GA3含量較低，子房較短的自交系含量較高；WI7120的ABA含量最高，WI7200最低，其他自交系間無顯著差異；9930的JA含量較高，True Lemon、WI7200和WI7237較低，其他自交系間無顯著差異。

表3 不同果型黃瓜開花當天子房內(nèi)源激素含量的比較Table 3 Comparison of endogenous hormone content of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis ng/g

由表4可知，不同果型黃瓜自交系中，IAA含量與子房長度和子房形狀指數(shù)有極顯著正相關性，與子房橫徑有極顯著負相關性，說明IAA可能通過促進子房伸長，抑制子房橫向增長而影響黃瓜果型的形成。ZT含量與子房橫徑有顯著正相關性，說明ZT對子房橫徑的生長有促進作用；ZT含量與子房橫切面細胞面積有極顯著正相關性，而與橫切面細胞密度有顯著負相關性，說明ZT可能通過促進子房橫切面細胞面積增大而促進子房橫徑生長。tZR含量與子房橫徑和子房橫切面細胞數(shù)目有顯著負相關性，說明tZR可能通過抑制橫切面細胞分裂影響子房橫徑大小。GA3含量與子房長度、子房形狀指數(shù)和子房縱切面細胞數(shù)目均有極顯著負相關性，說明GA3可能通過抑制縱切面細胞分裂影響子房長度和子房形狀指數(shù)。ABA和JA含量總體而言對子房相關指標影響不大。

表4 不同果型黃瓜開花當天子房大小和細胞相關性狀與內(nèi)源激素含量的相關性Table 4 Correlation among ovary size and cell traits and endogenous hormone content in cucumbers with different fruit sizes and shapes at anthesis

3 討 論

果實最終大小取決于花前因素和果實的早期生長[11]，可以根據(jù)子房期的果型預測黃瓜成熟果實的果型[7]。本研究通過比較不同果型黃瓜子房縱、橫切面的細胞數(shù)目、細胞面積和細胞密度，在組織學水平上揭示了黃瓜果型差異的原因。前人的研究表明，不同品種間果實大小主要是由細胞數(shù)目而不是細胞大小決定的，例如甜瓜[12]、甜櫻桃[13]、桃[14]和梨[15]等作物。本研究結果與上述結果基本相同，但上述研究僅比較了果實縱切面或橫切面細胞，本研究則同時對縱切面和橫切面細胞數(shù)目進行了比較，發(fā)現(xiàn)縱、橫切面細胞數(shù)目分別與子房長度和橫徑有極顯著相關性，子房縱橫切面細胞面積和細胞密度與子房長度或子房橫徑及子房形狀指數(shù)均無顯著相關性，說明子房長度和橫徑的差異是由細胞數(shù)目的差異引起的，且子房長度和橫徑均與子房形狀指數(shù)顯著相關，進一步表明黃瓜果型差異主要是由細胞數(shù)目決定的。但對于子房橫徑而言，種腔橫徑與子房橫徑之間有極顯著正相關性，說明除子房橫切面細胞數(shù)目外，種腔橫徑也對黃瓜子房橫徑有一定作用，從而影響黃瓜的果型。

IAA是參與調節(jié)植物生長發(fā)育的重要激素，影響細胞的擴增和分裂、細胞的伸長和分化以及多種生理反應，從而影響植物細胞和組織的形狀和功能[16-18]。有研究表明，一定濃度的IAA對黃瓜果實有顯著促進作用[19]。本研究中IAA含量與子房長度有極顯著正相關性，子房期的黃瓜果實處于果實發(fā)育的早期階段，為細胞分裂的旺盛期，不同自交系縱切面細胞數(shù)目的大小順序與子房長度相似，然而縱切面細胞面積除WI7204與AM66較大外，其余自交系之間無顯著差異，說明IAA可能通過促進細胞分裂來促進黃瓜子房的伸長。IAA含量與子房橫徑和橫切面細胞數(shù)目均有極顯著負相關性，說明IAA主要促進黃瓜子房縱向伸長，并在一定程度上通過阻礙子房橫向細胞的分裂來抑制黃瓜子房橫向生長。ZT可以促進細胞分裂，ZT含量與子房縱切面細胞數(shù)目有顯著正相關性，表明ZT可以促進黃瓜子房縱切面細胞分裂；ZT也可以促使細胞體積擴大，它的主要作用是使細胞橫向擴大，而不是縱向伸長[20]。本研究中ZT含量與子房橫徑有顯著相關性，與子房橫切面細胞面積和細胞密度分別有極顯著正相關性和顯著負相關性，說明ZT主要通過增加子房橫向細胞面積促進黃瓜子房橫向增長。tZR含量與子房橫徑和子房橫切面細胞數(shù)目均有顯著負相關性，表明tZR對子房橫向細胞分裂可能有抑制作用。GA3與IAA在促進細胞分裂和細胞伸長方面具有重要功能[21]，但GA3是促進生長還是抑制生長(尤其是黃瓜果實)與其濃度有著極為密切的關系，低濃度時抑制生長，而高濃度時則表現(xiàn)為促進生長，而且其對瓜條縱向生長的促進作用遠大于橫向[19]。本研究中GA3含量與子房長度、子房形狀指數(shù)和子房縱切面細胞數(shù)目均有極顯著負相關性，表明GA3可能通過抑制縱切面細胞分裂影響子房長度。有研究發(fā)現(xiàn)，在黃瓜子房期中,CsSUN和CsLNG1抑制細胞膨脹相關基因的表達并減小GA3/ABA值，可使細胞相比其他材料變小，細胞密度相對變大，導致子房相對變大[22]。綜上分析認為，IAA、ZT、tZR、GA3的含量均與黃瓜子房大小和形狀有關。