新型二氫葉酸還原酶抑制劑iclaprim對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性

郝凌云， 何春燕， 楊 涵， 陳雯靜， 崔澤林， 湯 榮， 舒 文， 劉慶中

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是臨床上引起皮膚軟組織感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎和血流感染等疾病的常見(jiàn)病原菌。由于抗菌藥物的廣泛使用導(dǎo)致金葡菌耐藥性不斷增強(qiáng)，給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)較大威脅[1]。

二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）是細(xì)菌葉酸合成和DNA復(fù)制過(guò)程的重要生物合成酶[2]。其新型選擇性抑制劑iclaprim是基于甲氧芐啶的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)優(yōu)化設(shè)計(jì)合成，與DHFR更具親和力，具有更強(qiáng)的體內(nèi)外抗金葡菌（包括MRSA）活性，并能抑制金葡菌毒素表達(dá)[3-4]。研究顯示，iclaprim在血漿中具有快速殺菌作用[5]，該藥針對(duì)金葡菌皮膚軟組織感染及院內(nèi)肺炎治療目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)[2]。

為了解iclaprim對(duì)本地區(qū)細(xì)菌的體外抗菌活性，本研究收集了上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床分離的金葡菌498株，檢測(cè)其對(duì)iclaprim的敏感性，并與甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑比較。同時(shí)，探討iclaprim與磺胺類藥物聯(lián)合使用對(duì)金葡菌的體外協(xié)同作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2016年1月—2018年12月我院分離自各種臨床標(biāo)本的非重復(fù)金葡菌498株。所有菌株均經(jīng)VITEK 2-Compact微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。金葡菌ATCC 25923 （紙片法）和ATCC 29213（肉湯微量稀釋法）為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株。

1.1.2 儀器和試劑 VITEK 2-Compact微生物鑒定系統(tǒng)及配套鑒定卡片為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；iclaprim粉劑為美國(guó)MedChemExpress（MCE）公司產(chǎn)品；甲氧芐啶和磺胺甲唑粉劑購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；頭孢西丁紙片（30 μg /片）為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品；陽(yáng)離子調(diào)節(jié)Mueller–Hinton（MH）肉湯購(gòu)于美國(guó)BD公司；96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板由美國(guó)Corning公司提供。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 參照CLSI 2019年推薦的肉湯微量稀釋法[6]檢測(cè)iclaprim、甲氧芐啶、磺胺甲唑、iclaprim-磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑?qū)甑淖畹鸵志鷿舛龋∕IC）。各種藥物檢測(cè)濃度范圍：iclaprim為0.015～16 mg/L，甲氧芐啶為0.015～64 mg/L，磺胺甲唑?yàn)?6～1 024 mg/L，甲氧芐啶-磺胺甲唑（1∶19）為（0.015-0.285）～（16-304） mg/L，iclaprim-磺胺甲唑（仿照甲氧芐啶-磺胺甲唑配方，1∶19）為（0.015-0.285）～（8-152） mg/L。

1.2.2 結(jié)果判定 以甲氧芐啶MIC≤8 mg/L為敏感，≥16 mg/L為耐藥；磺胺甲唑MIC≤256 mg/L為敏感，≥512 mg/L為耐藥；甲氧芐啶-磺胺甲唑MIC≤2-38 mg/L為敏感，≥4-76 mg/L為耐藥[6]。iclaprim目前并無(wú)發(fā)布的臨床折點(diǎn)，根據(jù)MRSA的MIC值分布、藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)及Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果，文獻(xiàn)[7]建議iclaprim對(duì)金葡菌的MIC≤1 mg/L為敏感。iclaprim-磺胺甲唑聯(lián)合藥敏試驗(yàn)用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（FIC） （FIC=評(píng)估。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，1＜FIC≤2為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用[8]。

1.2.3 甲氧西林敏感性檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，頭孢西丁紙片法檢測(cè)金葡菌對(duì)甲氧西林的敏感性，抑菌圈直徑≤21 mm為耐藥（即MRSA），≥22 mm為敏感（即MSSA）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲氧西林耐藥性

498株金葡菌中，268株（53.8%）對(duì)甲氧西林耐藥，為MRSA；230株（46.2%）敏感，為MSSA。

2.2 iclaprim和iclaprim-磺胺甲唑的MIC分布

498株金葡菌中，iclaprim的MIC范圍為0.015～＞16 mg/L， MIC50、MIC90為0.25、0.5 mg/L。根 據(jù)MIC50、MIC90值，MRSA（0.25、0.5 mg/L）和MSSA（0.12、0.25 mg/L）間僅有1個(gè)稀釋梯度的差別，因此iclaprim對(duì)兩者具有相似的抗菌能力。所有菌株中，有35株（7.0%）對(duì)iclaprim敏感性降低（MIC＞1 mg/L），且不敏感率在MRSA和MSSA菌株間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（8.6%對(duì)5.2%，χ2=2.145，P=0.143）。iclaprim 對(duì)金葡菌的MIC值分布見(jiàn)表1。

表1 Iclaprim、甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 1 In vitro activities of iclaprim, trimethoprim, sulfamethoxazole, and trimethoprim-sulfamethoxazole against S. aureus isolates

表1 Iclaprim、甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 1 In vitro activities of iclaprim, trimethoprim, sulfamethoxazole, and trimethoprim-sulfamethoxazole against S. aureus isolates

a Intermediate or resistant (nonsusceptible).MRSA, methicillin-resistant S. aureus; Trimethoprim-sulfamethoxazole combination =1:19; MSSA, methicillin-sensitive S. aureus.

Bacteria /Antimicrobial agent MIC range/(mg/L) MIC50 /(mg/L) MIC90/(mg/L) Ra/% S/%MRSA (n=268)Iclaprim 0.06-＞16 0.25 0.5 8.6 91.4 Trimethoprim 0.5-＞64 2 16 10.0 90.0 Sulfamethoxazole 32-1024 128 256 9.0 91.0 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.5 5.6 94.4 MSSA (n=230)Iclaprim 0.015-＞16 0.12 0.25 5.2 94.8 Trimethoprim 1-＞64 2 4 8.7 91.3 Sulfamethoxazole 16-1024 128 128 2.2 97.8 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.12 5.2 94.8 S. aureus (n=498)Iclaprim 0.015-＞16 0.25 0.5 7.0 93.0 Trimethoprim 0.5-＞64 2 8 9.6 90.4 Sulfamethoxazole 16-1024 128 256 5.8 94.2 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.25 5.4 94.6

2.3 iclaprim對(duì)甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥菌株的抗菌活性

表1顯示，有48株（9.6%）、29株（5.8%）和27株（5.4%）的金葡菌分別對(duì)甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥。金葡菌對(duì)iclaprim的不敏感率較低（7.0%），與上述三種藥的耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.136、0.438和0.294，P＞0.05）48株甲氧芐啶耐藥菌的iclaprim MIC范圍為0.12～＞16 mg/L，比全部金葡菌的范圍窄4個(gè)稀釋梯度，其中43.8%（21/48）對(duì)iclaprim不敏感；29株磺胺甲唑耐藥菌的iclaprim MIC范圍為0.06～＞16 mg/L，44.8%（13/29）對(duì)iclaprim不敏感；27株甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥菌的iclaprim MIC范圍為2～＞16 mg/L（全不敏感），更是比甲氧芐啶耐藥金葡菌又下降了4個(gè)稀釋梯度。需要指出的是，無(wú)論甲氧芐啶、磺胺甲唑和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥與否，都有iclaprim MIC較高的菌株（≥16 mg/L）。對(duì)于三種藥物耐藥的MRSA，iclaprim的抗菌活性也顯著低于其敏感的MRSA菌株（根據(jù)MIC90值相差≥32倍）。不過(guò)無(wú)論甲氧西林耐藥與否，三種藥物耐藥的菌株都具有很高的iclaprim MIC90值（≥16 mg/L）。

3 討論

DHFR參與細(xì)菌葉酸和胸苷合成，是抗菌藥物開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)[9-10]。甲氧芐啶作為FDA唯一批準(zhǔn)的DHFR抑制劑使用已近40年[10]，出現(xiàn)了與其親和力降低的DHFR突變型（如金葡菌DHFR的F98Y突變）[11-13]，導(dǎo)致抗菌活性下降[14]。由于抗菌活性相對(duì)較差，且易于產(chǎn)生耐藥性，臨床上甲氧芐啶常與增效劑磺胺甲唑聯(lián)合使用（即甲氧芐啶-磺胺甲唑）[9]。不過(guò)，甲氧芐啶-磺胺甲唑能引起磺胺相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)、惡液質(zhì)、肝毒性等[15]。而iclaprim是一種單藥成分，沒(méi)有上述安全缺陷，效力比甲氧芐啶提高了近20倍[16]，與甲氧芐啶-磺胺甲唑具有相似的抗菌能力[2,16]。因此，iclaprim有可能成為金葡菌感染的替代治療藥物。

表2 Iclaprim聯(lián)合磺胺甲唑?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 2 In vitro antimicrobial activity of iclaprim in combination with sulfamethoxazole against S. aureus isolates

表2 Iclaprim聯(lián)合磺胺甲唑?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抗菌活性Table 2 In vitro antimicrobial activity of iclaprim in combination with sulfamethoxazole against S. aureus isolates

Iclaprim-sulfamethoxazole combination= 1:19. MRSA, methicillin-resistant S. aureus; MSSA, methicillin-sensitive S. aureus.

Bacteria/ Antimicrobial agent Fractional inhibitory concentration /n (%)≤ 0.5(Synergy） 0.5 to ≤ 1(Additive) 1 to ≤ 2(Indifference) ＞2(Antagonism)MRSA (n=268)Iclaprim 266 (99.3) 2 (0.7) 0 0 Sulfamethoxazole MSSA (n=230)Iclaprim 230 (100) 0 0 0 Sulfamethoxazole S. aureus (n=498)Iclaprim 496 (99.6) 2 (0.4) 0 0 Sulfamethoxazole Bacteria/ Antimicrobial agent Single antibiotic/(mg/L) Iclaprim-sulfamethoxazole combination/(mg/L)a MIC range MIC50 MIC90 MIC range MIC50 MIC90 Synergism MRSA (n=268)Iclaprim 0.06->16 0.25 0.5 0.015-8 0.015 0.03 8-16 Sulfamethoxazole 32-1024 128 256 0.285-152 0.285 0.57 449 MSSA (n=230)Iclaprim 0.015->16 0.12 0.25 0.015-8 0.015 0.03 8 Sulfamethoxazole 16-1024 128 128 0.285-152 0.285 0.57 224-449 S. aureus (n=498)Iclaprim 0.015->16 0.25 0.5 0.015-8 0.015 0.03 16 Sulfamethoxazole 16-1024 128 256 0.285-152 0.285 0.57 449

目前，國(guó)際上已有iclaprim體外抗菌活性的報(bào)道[7,17-21]，不過(guò)我國(guó)仍然缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。北美和歐洲的數(shù)據(jù)顯示，iclaprim對(duì)金葡菌具有高度活性（MIC50、MIC90為0.03～0.06、0.12 mg/L），南 美和亞太地區(qū)的金葡菌也具有較低的MIC50、MIC90（0.06、0.12 mg/L）[7,17-18]。本結(jié)果顯示，絕大多數(shù)臨床金葡菌（93.0%）對(duì)iclaprim敏感，但MIC50、MIC90值（0.25、0.5 mg/L）要高于上述國(guó)外報(bào)道，表明iclaprim對(duì)本研究菌株的活性弱于國(guó)外菌株4～8倍。出現(xiàn)這種情況可能與我國(guó)流行的菌株克隆與國(guó)際上其他地區(qū)不同有關(guān)。另外，本研究還顯示iclaprim對(duì)金葡菌的活性基本不受甲氧西林的耐藥性影響，MRSA和MSSA菌株的MIC50、MIC90值僅相差1個(gè)稀釋梯度。

iclaprim對(duì)F98Y DHFR能維持足夠的親和力[4]。但是，本研究并未觀察到iclaprim與甲氧芐啶在耐藥率上存在顯著差異，而且43.7%甲氧芐啶耐藥菌株對(duì)iclaprim不敏感。這一結(jié)果提示，DHFR可能存在新的突變或存在其他導(dǎo)致iclaprim抗菌活性降低的機(jī)制。

在本課題研究中，iclaprim對(duì)MSSA（MIC50、MIC90：0.12、0.25 mg/L）的活性是甲氧芐啶（MIC50、MIC90：2、4 mg/L）的16倍，iclaprim對(duì)MRSA（MIC50、MIC90：0.25、0.5 mg/L）的活性是甲氧芐啶（MIC50、MIC90：2、16 mg/L）的8～32倍；對(duì)MSSA，與甲氧芐啶-磺胺甲唑（MIC50、MIC90：0.06、0.12 mg/L）相比，iclaprim的活性稍弱，而對(duì)MRSA則與甲氧芐啶-磺胺甲唑相當(dāng)（MIC90：0.5 mg/L）（ 表1）。但就金葡菌總體而言，iclaprim（MIC50、MIC90：0.25、0.5 mg/L）的活性是甲氧芐啶（MIC50、MIC90：2、8 mg/L）的8～16倍，這一數(shù)據(jù)也與國(guó)外的報(bào)道（8～32倍）基本一致[7]。

Huang等[22]報(bào)道，iclaprim對(duì)甲氧芐啶和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥金葡菌國(guó)際菌株（歐美、亞太、拉丁美洲、非洲、中東等地區(qū)）的MIC90分別為＞16 mg/L和＞8 mg/L。而iclaprim對(duì)上述同類藥物耐藥菌株同樣具有較低的體外活性，MIC50、MIC90值分別達(dá)1、16 mg/L和＞16、＞16 mg/L。由此可見(jiàn)，對(duì)甲氧芐啶和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥的菌株，也會(huì)顯著增強(qiáng)對(duì)iclaprim耐藥性，尤其是后者，其中原因需要進(jìn)一步探討。

總之，iclaprim作為一種新型DHFR抑制劑，對(duì)金葡菌有很好的體外抗菌活性，如與磺胺類藥物聯(lián)合使用效果會(huì)更好，可能具有廣泛的應(yīng)用前景。不過(guò)，研究中也發(fā)現(xiàn)了少量iclaprim MIC值較高的菌株，其機(jī)制仍需深入研究，為防控耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播提供對(duì)策。