邵軍?鄭曉明?劉瓊?朱凝?趙靈智?魏波

【摘要】目的 合成特異性靶向胃癌納米粒子，借助自主搭建的近紅外熒光腹腔鏡，探討該納米粒子在胃癌精確診斷及完整切除中的價(jià)值。方法 將吲哚菁綠（ICG）通過(guò)自主裝方式包覆于雙親性聚合物二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-Mal），同時(shí)，用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽修飾，制備靶向納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG。通過(guò)核磁譜圖驗(yàn)證產(chǎn)物，吸收光譜檢測(cè)光學(xué)性質(zhì)。建立小鼠胃癌皮下瘤模型，在自主搭建的近紅外熒光腹腔鏡下檢測(cè)及切除腫瘤。結(jié)果 核磁譜圖驗(yàn)證產(chǎn)物與預(yù)期相符，并表現(xiàn)出與游離ICG相似的吸收光譜。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，DSPE-PEG-RGD@ICG可特異性靶向胃癌，指導(dǎo)胃癌的完整切除。靜脈給藥4 h后，熒光腹腔鏡可清楚顯示腫瘤位置。小鼠胃癌皮下瘤檢出率為91.8%，檢出腫瘤的最小直徑為4.9 mm。結(jié)論 成功制備了特異性靶向胃癌的納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG，其光學(xué)特性與ICG相似，在近紅外熒光腹腔鏡引導(dǎo)下，可有效地協(xié)助外科醫(yī)師對(duì)小鼠胃癌皮下瘤進(jìn)行定位及完整切除。

【關(guān)鍵詞】近紅外熒光腹腔鏡;熒光納米粒子;吲哚菁綠;胃癌

Experimental study of near-infrared imaging of fluorescent nanoparticles in gastric cancer mouse models with subcutaneous tumors Shao Jun， Zheng Xiaoming， Liu Qiong， Zhu Ning， Zhao Lingzhi， Wei Bo. Department of Gastrointestinal Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wei Bo， E-mail： weibo3@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To synthesize a gastric cancer-specific nanoparticle and to explore the value of the nanoparticle in accurate diagnosis and complete resection of gastric cancer under the guidance of self-built near-infrared fluorescence laparoscopy. Methods Indocyanine green （ICG） was encapsulated into the amphiphilic polymer distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-Maleimide （DSPE-PEG-Mal） by self-assembly method. And the surface of the polymer was modified with arginine-glycine-aspartic acid polypeptide （RGD） to prepare targeted nanoparticles DSPE-PEG-RGD@ICG. The product was verified by NMR and the optical properties were detected by absorption spectrum. The gastric cancer mouse models with subcutaneous tumors were established， and the tumors were detected and resected under self-built near infrared fluorescence laparoscopy. Results The NMR spectra showed that the product was consistent with the expected product and showed a similar absorption spectra to free ICG. In in vivo experiment， DSPE-PEG-RGD@ICG could specifically target gastric cancer and guide the complete resection of tumors. At 4 h after intravenous administration， the location of tumors could be clearly displayed by fluorescence laparoscopy. The detection rate of subcutaneous tumors in gastric cancer mouse models was 91.8%， and the minimum diameter of detected tumors was 4.9 mm. Conclusions The successfully prepared nanoparticles targeting gastric cancer have optical properties similar to that of ICG， which can effectively assist surgeons in the complete resection of subcutaneous tumors in gastric cancer mice under the guidance of self-built fluorescence endoscopy system.

【Key words】Near-infrared laparoscopy;Fluorescent nanoparticle;Indocyanine green;Gastric cancer

胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，其癌癥相關(guān)死亡率在所有癌癥中居第二位，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生活質(zhì)量[1]。目前，腹腔鏡胃切除術(shù)已被廣泛接受為治療胃癌的一種微創(chuàng)手術(shù)[2]。對(duì)于早期胃癌，內(nèi)鏡手術(shù)，如內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)（EMR）和內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD），也被越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床[3-4]。盡管如此，無(wú)典型體征或輕度典型體征給早期胃癌的診斷帶來(lái)很大困難，大多數(shù)胃癌患者初診時(shí)已經(jīng)是中晚期。早期胃癌的5年生存率可達(dá)到90%，而中晚期胃癌患者的5年生存率約為10% ～ 30%[5-6]。此外，由于缺乏直接觸覺(jué)感受，外科醫(yī)師對(duì)腹腔鏡手術(shù)中的腫瘤精確定位及判斷也存在一定的難度。因此，如何提高胃癌的早期診斷及精準(zhǔn)完整的切除是胃癌診療過(guò)程中亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)，吲哚菁綠（ICG）引導(dǎo)下的近紅外成像技術(shù)逐漸應(yīng)用于腹腔鏡胃癌根治手術(shù)，但由于游離ICG存在缺乏腫瘤靶向特異性，不穩(wěn)定，容易淬滅等缺陷，目前ICG并未廣泛應(yīng)用于臨床[7-8]。

本研究通過(guò)雙親性聚合物二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-Mal）包覆ICG，形成水溶性熒光納米粒子。并用能與整合素αvβ3特異性結(jié)合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽進(jìn)行修飾，合成具有腫瘤特異性的靶向熒光納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG，用以胃癌可視化成像及精準(zhǔn)切除。本研究使用自主搭建的近紅外熒光腹腔鏡，在小鼠的胃癌皮下瘤模型中驗(yàn)證了該熒光納米粒子的胃癌靶向性，為臨床上客觀指導(dǎo)外科醫(yī)師早期及精準(zhǔn)切除胃癌提供了一個(gè)新的策略。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

胃癌SGC7901細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于廣州貝奧吉因生物技術(shù)有限公司。DSPE-PEG-Mal（Kw = 2000）購(gòu)于上海炎怡生物科技有限公司。ICG購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，RGD多肽購(gòu)于上海吉爾生化有限公司。雌性BALB/c裸鼠（3 ～ 5周）購(gòu)于北京維頓利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。

二、納米材料的合成與表征

通過(guò)自組裝方式將ICG包覆于納米粒子中，通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)將RGD連接于表面，形成具有靶向功能的熒光納米粒子，命名為DSPE-PEG-RGD@ICG。

具體合成過(guò)程如下：分別稱(chēng)取20 mg DSPE-PEG-Mal凍干粉和6.7 mg ICG，將兩者混合溶于3 ml四氫呋喃，超聲混合充分，再在超聲探頭的超聲環(huán)境中，將混合溶液逐滴加入20 ml純水，超聲30 min，轉(zhuǎn)移至3500 Da透析袋，透析24 h去除雜質(zhì)，凍干保存。稱(chēng)取20 mg制備的凍干粉，溶于5 ml純水，加入6 mg RGD多肽，攪拌反應(yīng)4 h后，用1000 Da透析袋24 h，凍干保存?zhèn)溆茫吹玫骄哂邪邢蛐缘腄SPE-PEG-RGD@ICG熒光納米粒子。通過(guò)核磁譜圖驗(yàn)證產(chǎn)物的合成。然后取適量的樣品均勻分散在超純水中，配制成ICG濃度為10 μg/ml的溶液，在室溫條件下用紫外-可見(jiàn)光分光光度儀進(jìn)行測(cè)定，記錄500 ～ 900 nm范圍內(nèi)的光譜。

三、近紅外熒光腹腔鏡的搭建

采用785 nm光纖耦合激光器（MW-GX- 785/1500 mW，長(zhǎng)春飛秒科技有限公司，中國(guó)）作為激發(fā)光光源，可見(jiàn)光光源使用醫(yī)用LED冷光源（AGS100，梧州奧格森科技有限公司，中國(guó)）。內(nèi)窺鏡（11.0031a，Scholly Fiberoptic GMBH，德國(guó)），直徑10 mm，工作長(zhǎng)度344 mm，0°視角?；诜止饫忡R的雙圖像傳感器集成工業(yè)相機(jī)（BV-C8820CL，Bluevision Ltd，日本）實(shí)現(xiàn)可見(jiàn)光與近紅外熒光的同時(shí)成像。選用智能圖像采集卡（microEnable-5-Marathon-ACL，Silicon Software，德國(guó)），通過(guò)E-Vision CL線纜與集成相機(jī)的數(shù)據(jù)接口相連接，能高速傳輸?shù)接?jì)算機(jī)。并自主開(kāi)發(fā)了一款適用于該成像系統(tǒng)的軟件，運(yùn)行環(huán)境為Windows 10操作系統(tǒng)，將圖像采集卡采集到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)軟件處理后經(jīng)顯示器顯示。

四、裸鼠胃癌皮下瘤模型的建立及熒光可視化成像

用3 ～ 5周齡雌性BALB/c裸鼠及胃癌細(xì)胞株SGC7901建立胃癌皮下瘤模型。將含有5×106個(gè)SGC7901細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液（0.2 ml）注射到裸鼠腋下，每隔1 d測(cè)量1次腫瘤大小，并計(jì)算體積：體積=長(zhǎng)軸×短軸2/2。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到150 mm3左右時(shí)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。選擇9只荷瘤小鼠隨機(jī)分成3組，每組各3只，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，分別尾靜脈注射0.2 ml ICG、DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG溶液（每只小鼠ICG當(dāng)量為2 mg/kg）。在特定的時(shí)間間隔（0.5、1、2、4、6 h）用自主搭建的熒光腹腔鏡對(duì)小鼠進(jìn)行熒光可視化成像，觀察并記錄不同藥物在小鼠體內(nèi)的分布情況。

五、近紅外熒光成像指導(dǎo)下的精準(zhǔn)手術(shù)

選擇50只小鼠，皮下瘤模型建立9 d后（腫瘤直徑為4 ～ 5 mm）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。于術(shù)前4 h經(jīng)尾靜脈注射DSPE-PEG-RGD@ICG納米粒子（劑量與前保持一致）。隨后麻醉小鼠并在熒光腹腔鏡引導(dǎo)下進(jìn)行腫瘤切除。手術(shù)期間，通過(guò)實(shí)時(shí)白光/NIR熒光切換將腫瘤部位可見(jiàn)的熒光組織全部切除，記錄腫瘤大小，并將切下的組織送病理檢查。

結(jié)果

一、DSPE-PEG-RGD@ICG的合成及光譜

DSPE-PEG-RGD@ICG的合成方式如圖1A所示，首先利用自組裝方式將ICG包覆于DSPE-PEG-Mal中，然后利用邁克爾加成反應(yīng)將RGD多肽連接于納米粒子表面，動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得產(chǎn)物粒徑為（147.6±3.9）nm。DSPE-PEG-RGD核磁譜圖如圖1B所示，在7.43 ppm及6.47 ppm處出現(xiàn)新的吸收峰，這兩處為RGD分子結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上氫的吸收峰，可判斷RGD成功接在DSPE-PEG-Mal上，證實(shí)RGD成功修飾于納米粒子表面。DSPE-PEG-RGD@ICG和ICG的吸收光譜如圖1C所示，與游離ICG表現(xiàn)出類(lèi)似的光學(xué)特性，表明DSPE-PEG-RGD@ICG未改變ICG的熒光性質(zhì)。

二、近紅外熒光腹腔鏡的搭建及測(cè)試

熒光腹腔鏡內(nèi)部結(jié)構(gòu)原理圖及實(shí)物圖見(jiàn)已發(fā)表文獻(xiàn)[9]。激光照射后，不同濃度ICG水溶液發(fā)射出不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。該成像系統(tǒng)能敏感捕捉到ICG濃度變化帶來(lái)的光學(xué)信號(hào)的改變，表明該近紅外成像系統(tǒng)搭建成功，見(jiàn)圖2。

三、荷瘤小鼠熒光可視化成像

通過(guò)構(gòu)建裸鼠胃癌SGC7901皮下瘤模型，觀察納米粒子的體內(nèi)生物分布情況。尾靜脈注射不同熒光藥物后，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集各組小鼠的熒光信號(hào)，見(jiàn)圖3。3組靜脈給藥后，熒光信號(hào)迅速分布全身，主要集中于肝臟。隨著時(shí)間的延續(xù)，3組熒光藥物逐漸被肝臟代謝，熒光信號(hào)相應(yīng)減弱。2 h后，游離ICG組僅在肝臟和腫瘤區(qū)域殘留微弱的熒光信號(hào)，而DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG組在腫瘤部位仍有較高的熒光積累。

4 h后，肉眼下，游離ICG組腫瘤部位基本觀察不到綠色熒光，DSPE-PEG-RGD@ICG組在腫瘤部位的綠色熒光清晰可見(jiàn)，與非靶向納米粒子DSPE-PEG@ICG組相比，能較好地顯示出腫瘤輪廓。6 h后，切開(kāi)皮膚，解剖腫瘤，在熒光腹腔鏡輔助下，DSPE-PEG-RGD@ICG組腫瘤組織與正常組織可以較好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。與游離ICG相比，DSPE-PEG-RGD@ICG在體內(nèi)具有更好的胃癌靶向能力。同時(shí)，最佳的手術(shù)操作時(shí)間是在靜脈給藥4 h后，此時(shí)，腫瘤部位熒光信號(hào)較強(qiáng)，其余部位如肝臟殘留的熒光信號(hào)的影響較小。

四、熒光腹腔鏡輔助下的胃癌小鼠模型的腫瘤切除

根據(jù)活體成像結(jié)果，經(jīng)尾靜脈注射DSPE-PEG-RGD@ICG 4 h后，利用熒光腹腔鏡切除腫瘤，見(jiàn)圖4A。構(gòu)建50只小鼠胃癌皮下瘤模型，造模9 d后，皮下腫塊平均直徑為5.49 mm，見(jiàn)圖4B。調(diào)整好參數(shù)后，將視野內(nèi)可見(jiàn)的綠色熒光信號(hào)組織全部切除，同時(shí)送病理分析，證實(shí)是否為癌組織，見(jiàn)圖4C。對(duì)于熒光下未顯影的可疑腫塊一并切除送檢。1只小鼠皮下瘤模型病理下未見(jiàn)癌細(xì)胞，考慮為炎性組織，同時(shí)未能檢測(cè)到熒光信號(hào);4只小鼠腫瘤熒光下未顯影（直徑分別為3.1、3.2、3.5和4.0 mm），考慮瘤塊較小，熒光信號(hào)較弱，未能檢測(cè)出來(lái);45只小鼠皮下瘤熒光下顯影，最終證實(shí)為癌組織，因此，納米粒子對(duì)構(gòu)建的胃癌模型檢出率為91.8%。

討論

既往研究表明，胃癌的治療效果與腫瘤分期及完整切除密切相關(guān)。目前，腹腔鏡胃癌根治術(shù)以其手術(shù)創(chuàng)傷小，術(shù)后恢復(fù)快等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于臨床，但仍存在一些弊端。對(duì)于早期胃癌，腫瘤位于黏膜或者黏膜下層，常常需要進(jìn)行術(shù)前定位或者術(shù)中聯(lián)合胃鏡來(lái)對(duì)腫瘤位置進(jìn)行定位。術(shù)前胃鏡下留置金屬夾標(biāo)記腫瘤位置存在夾子脫落導(dǎo)致定位失敗的風(fēng)險(xiǎn);術(shù)中胃鏡則需要專(zhuān)門(mén)的內(nèi)鏡醫(yī)師進(jìn)行操作，并且延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間[10]。對(duì)于進(jìn)展期胃癌，由于缺乏直接觸覺(jué)感受以及開(kāi)放手術(shù)的直接肉眼觀察，導(dǎo)致微小轉(zhuǎn)移灶不易被發(fā)現(xiàn)和切除。近年來(lái)，熒光成像技術(shù)在臨床中的應(yīng)用越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注，試圖通過(guò)熒光分子來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤的特異性顯像，達(dá)到精準(zhǔn)診療的目的。其中，納米載體是最常用的技術(shù)手段。

納米載體的發(fā)展是為了應(yīng)對(duì)藥物輸送的需要，這些方法解決了藥物溶解度低、非特異性細(xì)胞毒性、次優(yōu)藥物動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)，以及較低的生物藥效率的問(wèn)題[11-12]。藥物輸送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)是為了適應(yīng)癌癥的“主動(dòng)靶向”和“被動(dòng)靶向”。被動(dòng)靶向是藥物輸送系統(tǒng)可以通過(guò)增強(qiáng)腫瘤脈管系統(tǒng)開(kāi)窗進(jìn)入腫瘤，并利用實(shí)體瘤中觀察到的增強(qiáng)通透性和保留（EPR）的一種手段。由于腫瘤血管滲漏和腫瘤淋巴引流不良，EPR效應(yīng)允許腫瘤選擇性的攝取和保留納米顆粒。此外，聚合物的多種功能為進(jìn)一步改性提供可能，通過(guò)特異性配體修飾納米顆粒的表面來(lái)實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向。整合素在多種腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)，而在正常細(xì)胞和血管內(nèi)細(xì)胞中低表達(dá)，在癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[13]。有研究表明，整合素αvβ3在胃癌中廣泛表達(dá)，并可能有助于胃癌亞型的常規(guī)分類(lèi)[14]。本研究使用高表達(dá)整合素αvβ3的胃癌細(xì)胞SGC7901，建立胃癌皮下瘤模型。RGD多肽能夠與整合素特異性結(jié)合，是目前研究最多的腫瘤精確診斷和治療靶向分子之一。本研究選用RGD多肽修飾納米粒子表面，通過(guò)納米粒子的被動(dòng)靶向，以及RGD多肽的主動(dòng)靶向，實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞的靶向結(jié)合。該載藥系統(tǒng)并未改變ICG本身的光學(xué)特性。

既往研究表明，當(dāng)ICG濃度大于80 μg/ml時(shí)，由于形成二聚體和多聚體，熒光強(qiáng)度反而隨濃度的增加而下降[15]。本研究中該成像系統(tǒng)同樣觀察到了類(lèi)似的現(xiàn)象，表明該系統(tǒng)搭建成功?；铙w成像結(jié)果表明，與游離ICG和非靶向納米粒子DSPE-PEG@ICG相比，DSPE-PEG-RGD@ICG表現(xiàn)出更好的腫瘤靶向富集。靜脈給藥4 h后，在該熒光腹腔鏡輔助下，腫瘤部位的熒光信號(hào)高于周?chē)恼＝M織。為進(jìn)一步驗(yàn)證該納米粒子對(duì)微小腫瘤的檢出率，我們對(duì)50只荷瘤小鼠進(jìn)行手術(shù)。結(jié)果表明該系統(tǒng)對(duì)胃癌皮下瘤檢出率為91.8%，檢出腫瘤的最小直徑為4.9 mm。此外，該系統(tǒng)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤切除情況，對(duì)于術(shù)中殘留的少量熒光組織，切除后病理確診為腫瘤組織。既往研究表明，對(duì)于進(jìn)展期胃癌出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移的患者，術(shù)前輔助檢查如腹部超聲、CT和PET等很難發(fā)現(xiàn)小于5 mm的腫瘤結(jié)節(jié)，往往需要腹腔鏡檢查或脫落細(xì)胞學(xué)檢查[16]。本研究結(jié)果提示在該成像系統(tǒng)輔助下，DSPE-PEG-RGD@ICG在胃癌的精準(zhǔn)診斷及完整切除方面具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

綜上所述，為了實(shí)現(xiàn)胃癌的可視化成像及精準(zhǔn)切除，本研究構(gòu)建了一種RGD多肽修飾的熒光納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG。核磁譜圖證實(shí)產(chǎn)物的成功合成，吸收光譜顯示出與游離ICG相似的光學(xué)特性。借助自主搭建的熒光腹腔鏡，證實(shí)了該納米粒子在胃癌皮下瘤小鼠腫瘤部位的靶向富集，通過(guò)對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行熒光成像輔助下的腫瘤切除，表明該系統(tǒng)對(duì)胃癌檢出率為91.8%。目前，ICG近紅外成像技術(shù)在胃癌診療中的應(yīng)用尚處于探索階段，我們的研究結(jié)果為胃癌的精準(zhǔn)診斷及治療提供了一個(gè)新的策略。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-11-10）

（本文編輯：楊江瑜）