基于氮摻雜石墨烯及RecJf核酸外切酶誘導信號擴增的熒光傳感器檢測伏馬菌素B1

梁秀俊，趙鳳娟，肖陳貴，賀 星，金華麗，衛(wèi) 敏*

1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

2.深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518000

伏馬菌素B1(Fumonisin B1，F(xiàn)B1)是農(nóng)產(chǎn)品生長過程中主要由鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性真菌毒素。FB1多分布于以玉米為代表的谷物及制品中，能引起家畜急性中毒，損害動物免疫系統(tǒng)[1]。相關的研究表明，F(xiàn)B1的攝入與食管癌的發(fā)生具有較強的相關性[2]。為保障食品安全和公共衛(wèi)生健康，對FB1的檢測方法研究已成為科研人員關注的熱點。其中，熒光分析方法因操作簡便、無須復雜的樣品前處理、分析速度快而受到青睞。作為新型“化學抗體”，核酸適配體是在體外合成的能夠以高親和力和高特異性結合目標分子的單鏈DNA或RNA[3]。因其具有穩(wěn)定性好、易于合成、易于修飾等優(yōu)點，已作為新型識別探針用于構建熒光傳感器以提高檢測方法的選擇性及穩(wěn)定性[4]。

石墨烯具有獨特的吸附單鏈DNA (ssDNA)能力和熒光猝滅性能，在熒光傳感器構建中已經(jīng)得到廣泛應用[5-6]。研究表明，雜原子的取代不僅能有效地調(diào)節(jié)石墨烯電子結構，改善其物理化學性質(zhì)，優(yōu)化其多方面的性能。由于氮原子具有與碳原子近似的原子半徑和強的價鍵，使它成為碳基材料化學摻雜的合適選擇，氧官能團被含氮酰胺基取代并形成了氮與碳原子的共價鍵，生成的氮摻雜石墨烯(Nitrogen doped graphenes, NDGRs)，表現(xiàn)出諸多優(yōu)良的性能，例如，Siddiqui等[7]基于NDGRs對熒光染料羅丹明B (RhB)的吸附作用，建立檢測過氧化氫濃度的傳感策略，實驗結果表明NDGRs增強了熒光淬滅和吸附能力，所建立的傳感策略表現(xiàn)出良好的特異性。Dou等[8]采用DNA模板原位合成方法，在NDGRs上原位生長AuNPs，材料的分散性和催化活性顯著提高，所構建的傳感器用于監(jiān)測活癌細胞釋放的一氧化氮，體外監(jiān)測能達到亞摩爾級別的檢測限。目前，氮摻雜石墨烯與核酸適配體結合用于構建熒光傳感策略的研究還未見報道。RecJfExo是一種從5′到3′方向剪切ssDNA特異性核酸外切酶，它還能從5′末端逐步水解適配體靶標復合物中的DNA鏈[9]。這一特性已被用來開發(fā)高靈敏度適配體傳感器，實現(xiàn)信號放大策略。

作者結合核酸適配體親和性高、特異性強、穩(wěn)定性好、成本低的特點，借助RecJfExo催化剪切核酸適配體/靶標復合物的能力實現(xiàn)信號擴增，建立分析步驟簡單、靈敏度與穩(wěn)定性較高的新型熒光傳感器分析方法，用于FB1的檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

FB1的核酸適配體 (FAM-Aptamer)：5′-FAM- ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3′ ，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。FB1和RecJf外切酶分別購買于Acros公司和北京紐英倫生物科技有限公司。試驗所用的熒光儀器為日立F-7100熒光分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 傳感器的制備及對FB1的熒光檢測

NDGRs的制備參照參考文獻[10]。將一定量的石墨烯與三聚氰胺按物質(zhì)的量1∶ 1混合后置于管式爐，在氮氣氛圍下800 ℃處理2 h，冷卻至室溫，即可得到NDGRs。

將25 μL、40 μg/mL的NDGRs溶液與10 μL、1 μmol/L的FAM-Aptamer探針混合，并于37 ℃下溫和振蕩孵育30 min，使FAM-Aptamer探針吸附到NDGRs表面。孵育完成后向上述體系中同時加入10 μL、1 000 ng/mL的FB1與5 μL、1 U/μL RecJfExo，使用1×NE Buffer 2緩沖液將反應體系補充至200 μL，再溫和振蕩孵育120 min后進行熒光掃描。設置激發(fā)波長494 nm，發(fā)射波長測量范圍500～600 nm，記錄520 nm下的熒光強度。F0表示測量體系在不加入FB1時所獲得的熒光強度，F(xiàn)表示加入FB1時所獲得的熒光強度。

1.2.2 實際樣品檢測

將未受污染的玉米樣品經(jīng)研磨制成粉末，取5.0 g粉末并加入不同濃度的FB1，然后與25 mL萃取溶劑(甲醇與水的體積比為7∶ 3)混合，置于振蕩器振蕩30 min后，將所得物以5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm有機濾膜過濾上清液，使用1×NE Buffer 2緩沖液將濾液稀釋至100倍。根據(jù)上述預處理方法，分別制備出5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的FB1加標玉米樣品提取液。

取適量的啤酒于100 mL燒杯中，將其充分超聲處理去除二氧化碳等氣泡。稱取5 mL啤酒樣品與不同質(zhì)量濃度的FB1溶液混合于50 mL離心管中，加入20 mL的1×NE Buffer 2緩沖液，充分混合后直接用0.45 μm的水系濾膜過濾，并收集樣品處理濾液。取適量樣品處理濾液并用1×NE Buffer 2緩沖液將上清液稀釋至100倍，制備5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的FB1加標啤酒樣品提取液。

2 結果與分析

2.1 基于NDGRs與RecJf Exo的熒光傳感器對FB1的檢測原理

如圖1所示，當傳感體系中不存在FB1時，NDGRs既是作為負載FB1核酸適配體識別探針FAM-Aptamer的物理基底，也是一種熒光猝滅材料。單鏈FAM-Aptamer核酸堿基芳香環(huán)結構和NDGRs結構六角晶胞間產(chǎn)生強烈的π-π堆積作用，使其能夠吸附在NDGRs表面，熒光基團靠近NDGRs導致其熒光猝滅[11]。當加入FB1時，F(xiàn)B1與FAM-Aptamer特異性結合，F(xiàn)AM-Aptamer的構象發(fā)生變化并從NDGRs表面脫離形成FAM-Aptamer/FB1復合物，F(xiàn)AM基團遠離NDGRs，其熒光強度就會恢復。利用RecJfExo特異性剪切FAM-Aptamer/FB1復合物中單鏈FAM-Aptamer的能力，F(xiàn)AM-Aptamer被水解從而釋放出FB1，同時因FAM-Aptamer被水解成了單核苷酸片段[12]，F(xiàn)AM熒光基團也游離于傳感體系之中。釋放出的FB1再次和吸附于NDGRs表面的FAM-Aptamer發(fā)生特異性結合，形成下一次循環(huán)。RecJfExo的剪切靶標復合物的循環(huán)作用使得游離于傳感體系的FAM熒光基團增多，導致熒光信號明顯增大。

圖1 基于NDGRs與RecJf Exo的傳感器制備檢測FB1原理

2.2 NDGRs的表征

利用掃描電鏡和透射電鏡對制備的NDGRs進行形貌表征，結果如圖2所示?？梢钥闯鯪DGRs的薄片層狀結構清晰明顯，表面存在略微褶皺，大小為1～2 μm。

圖2 氮摻雜石墨烯的掃描電鏡形貌和透射電鏡形貌

利用X射線光電子能譜(XPS)對NDGRs進行物質(zhì)元素的定性分析，結果如圖3所示。可以看出，材料中含有C、N、O 3種元素，531 eV、399 eV和285 eV處的信號峰分別代表O 1 s、N 1 s和C 1 s。此外，N 1 s光譜在401.5、400.1和398.7 eV處有3個峰，分別對應于石墨-N、吡咯-N和吡啶-N。XPS分析表明，部分N元素已經(jīng)嵌入到NDGRs材料結構中，N含量約為5.53%。

圖3 NDGRs的X射線光電子能譜(XPS)分析

2.3 NDGRs的用量對FAM-Aptamer熒光探針猝滅性能的影響

NDGRs的用量對FAM-Aptamer熒光探針猝滅性能的影響如圖4所示。從圖4 A可看出，隨著材料質(zhì)量濃度的增加，猝滅效率逐漸增加，所獲得的熒光強度逐漸減弱最終趨于平緩。當NDGRs質(zhì)量濃度達到40 μg/mL時，超過80%的熒光信號被淬滅，說明使用較多的NDGRs可使單鏈FAM-Apatmer信號探針被更有效地吸附到材料表面。猝滅效率隨NDGRs質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加而增加，當質(zhì)量濃度達到60 μg/mL之后不再明顯變化。但是，當濃度超過40 μg/mL時，會影響其分散性及穩(wěn)定性，并且由光散射所產(chǎn)生的信號干擾可能會使傳感器的靈敏度降低[13]。圖4B顯示不同系列質(zhì)量濃度NDGRs存在下加入FB1前后所獲得的熒光強度。內(nèi)插圖為按照(F-F0)/F0計算不同的NDGRs質(zhì)量濃度下相對熒光強度比值?？梢钥闯?，隨著NDGRs質(zhì)量濃度的增加，測量體系的相對熒光強度比值先增大后減小，當NDGRs質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，由FB1引起的相對熒光強度比最大。內(nèi)插圖也反映出使用適當多的NDGRs可以更加有效地吸附單鏈FAM-Aptamer，提高猝滅效率。然而，過量的NDGRs可能會在FAM-Aptamer/FB1復合物周圍，導致熒光強度降低[14-15]。因此，NDGRs的最佳質(zhì)量濃度為40 μg/mL。

2.4 RecJf Exo用量的優(yōu)化

對RecJfExo的用量進行優(yōu)化，結果如圖5所示。熒光強度隨著酶用量的增加而逐漸增加，當酶量為5 U時達到最大。這可能是由于適配體靶標復合物被催化剪切的效率有所增加，導致越來越多的FAM熒光基團被釋放到傳感體系中。因此，RecJfExo的最佳用量為5 U。

2.5 傳感器對FB1的檢測

利用所制備的熒光傳感器對FB1檢測，結果如圖6所示。在傳感體系中僅有NDGRs與FAM-Aptamer信號探針孵育后，得到的熒光強度較低(曲線a)，說明NDGRs對信號探針起到了明顯的熒光猝滅，猝滅現(xiàn)象的發(fā)生可能主要是由于FAM熒光基團與NDGRs之間的FRET效應引起的。同時也表明了大量的FAM-Aptamer信號探針被有效吸附到NDGRs表面。在NDGRs與FAM-Aptamer信號探針孵育后，加入RecJfExo孵育2 h，熒光強度僅略微增加 (曲線b)，說明大部分的FAM-Aptamer仍負載于NDGRs表面，RecJfExo幾乎沒對信號探針進行水解。該現(xiàn)象證明了NDGRs保護單鏈寡核苷酸免受RecJfExo剪切的特性。當完成NDGRs對FAM-Aptamer信號探針負載后，向傳感體系中引入FB1，經(jīng)30 min孵育后，與未加入FB1時相比，熒光強度增加了64.7% (曲線c)。說明核酸適配體對FB1的高親和力誘導探針形成了FAM-Aptamer/FB1復合物，并導致復合物從NDGRs材料表面脫離，F(xiàn)AM基團熒光恢復。而當NDGRs與FAM-Aptamer信號探針孵育完成后向傳感體系中同時加入FB1與RecJfExo，得到的熒光強度相較于曲線c的熒光信號強度又進一步地增加了80.1%(曲線d)，此現(xiàn)象說明RecJfExo可以有效剪切FAM-Aptamer/FB1復合物中ssDNA，F(xiàn)AM-Aptamer/FB1復合物解體，F(xiàn)AM熒光基團與FB1均游離于傳感體系之中，被釋放的FB1會重復參與結合負載于NDGRs表面的FAM-Aptamer，進而導致更多的FAM熒光基團因信號探針被剪切而游離于傳感體系之中，說明RecJfExo剪切適配體靶標復合物引起的靶標循環(huán)信號擴增作用有顯著效果。

A.不同質(zhì)量濃度NDGRs與FAM-Aptamer孵育完成后所對應的熒光強度；B.不同質(zhì)量濃度NDGRs條件下，NDGRs/FAM-Aptamer測量體系中加入FB1孵育前后的熒光強度 (內(nèi)插圖為NDGRs質(zhì)量濃度與相對熒光強度比的關系)

[FAM-Aptamer]=1 μmol/L；[NDGRs]=40 μg/mL；[FB1]=50 ng/mL

a.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer；b.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+5 U RecJf Exo；c.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+50 ng/mL FB1；d.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+50 ng/mL FB1+5 U RecJf Exo

由圖7可以看出，隨著FB1質(zhì)量濃度的增加，熒光強度逐漸增加。當FB1的質(zhì)量濃度達到500 ng/mL以后，熒光強度未明顯變化。FB1質(zhì)量濃度在0.2～20 ng/mL及20～500 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關系，線性方程分別為F=9.02CFB1+192.27 (R2=0.991 5)和F=0.35CFB1+367.71 (R2=0.992 1)，檢出限為0.084 ng/mL (3σ)。與其他文獻的檢出限比較見表1。

2.6 傳感器的特異性研究

利用赭曲霉毒素A(OTA)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)對所制備傳感器的特異性進行研究。 FB1質(zhì)量濃度10 ng/mL，其他干擾毒素OTA、AFB1、ZEN的質(zhì)量濃度均為500 ng/mL。從圖8可以看出，盡管添加其他干擾毒素的濃度是FB1的50倍，但都不能引起傳感器顯著的信號響應，而只要傳感體系中存在FB1，熒光強度就有明顯增加，說明該傳感器具有良好的特異性。

曲線由下至上FB1質(zhì)量濃度依次為0、0.1、0.2、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL

表1 所制備傳感器與其他檢測FB1方法比較

(a)空白；(b)AFB1；(c)OTA；(d)ZEN；(e)FB1；(f)FB1+AFB1；(g)FB1+OTA；(h)FB1+ZEN；[FB1]=10 ng/mL；[AFB1]=[OTA]=[ZEN]=500 ng/mL

2.7 實際樣品檢測

利用所制備的傳感器對FB1加標玉米及啤酒檢測，結果如表2所示。加標玉米樣品中FB1的平均回收率為91%～103%，加標啤酒樣品中FB1的回收率為92%～97%，說明制備的傳感器適用于食品中FB1的檢測。

表2 FB1加標樣品的檢測結果 (n=6)

3 結論

利用具有較大比表面積及良好分散性的NDGRs有利于增強傳感器檢測性能的優(yōu)點，將其作為負載FB1核酸適配體識別探針的基底，建立了以RecJfExo催化剪切FAM-Aptamer/FB1復合物中單鏈FAM-Aptamer釋放FB1，觸發(fā)靶標循環(huán)信號擴增傳感策略，實現(xiàn)了FB1的高靈敏檢測。同時，該傳感器對加標玉米及加標啤酒樣品的檢測得到良好的回收率。