宏基因組技術(shù)在極端環(huán)境酯酶挖掘中的應(yīng)用

朱玉玲,彭 晶,唐詩哲,周凱燕,程海娜

(中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院,中國湖南長沙410083)

酯酶(esterase)可催化酯鍵水解生成醇和酸,也可催化逆反應(yīng)使羥基和羧基脫水縮合[1],具有反應(yīng)條件較溫和、反應(yīng)不需要輔酶、催化活性高以及選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、造紙、紡織、生物能源、皮革、環(huán)境治理、洗滌劑、新型材料、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。酯酶來源廣泛,其中來源于極端環(huán)境微生物的酯酶更適合工業(yè)應(yīng)用。但是,由于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)和測序技術(shù)的局限性[3],可培養(yǎng)微生物只占總數(shù)的很少一部分,對于物理化學(xué)條件復(fù)雜的極端環(huán)境,可培養(yǎng)微生物則更少[4]。宏基因組技術(shù)作為近年來發(fā)展起來的一種可以不依賴于微生物純培養(yǎng)而可以獲得環(huán)境中所有遺傳信息的方法,既可以研究微生物種類的多樣性,又可以尋找其中的新功能基因[5]。本文綜述了宏基因組方法在極端環(huán)境酯酶挖掘中的應(yīng)用現(xiàn)狀、面臨的挑戰(zhàn)以及日后的發(fā)展方向,旨在為進(jìn)一步開發(fā)性能更加優(yōu)良的酯酶提供參考。

1 酯酶的分類及來源

酯酶的分類有廣義與狹義之分。廣義上來說酯酶就是所有可以水解酯類的酶,主要有四大類,分別是羧酸酯酶、磷脂酶、硫酸酯酶和硫磷酯酶。而羧酸酯酶又可以分為兩種,分別為偏好作用于短鏈脂肪(碳鏈長度小于10)的酯酶和偏好作用于長鏈脂肪(碳鏈長度大于10)的脂肪酶。狹義的酯酶就是指羧酸酯酶分類下偏好水解短鏈脂肪的酯酶,本文提到的酯酶是狹義的酯酶。1999年,Arpigny和Jaeger提出基于氨基酸序列特點(diǎn)和生物學(xué)性質(zhì)將微生物酯酶分為8個(gè)家族[6]。雖然這種分類方式隨著酯酶新家族的發(fā)現(xiàn)有一些改動(dòng),但仍被沿用至今。

酯酶的主要來源有動(dòng)物、植物和微生物[7],其中微生物主要包括細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物。真菌中有12屬23種可產(chǎn)生酯酶,主要包含青霉、根霉、須霉、毛霉、鏈孢霉、紅曲霉、黑曲霉、黃曲霉和酵母菌等。能產(chǎn)生酯酶的細(xì)菌主要有鏈球菌、金黃色葡萄球菌、新型隱球菌、綠膿桿菌、結(jié)核桿菌以及一些極端嗜極古菌[8]。大多數(shù)工業(yè)酯酶來源于微生物,尤其是極端微生物。這是由于極端微生物來源的酯酶大都具有更寬的溫度和pH耐受范圍,熱穩(wěn)定性、對有機(jī)溶劑和抑制劑的耐受性也更高,能夠承受工業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)苛條件。

2 極端環(huán)境微生物與宏基因組技術(shù)

2.1 極端環(huán)境與極端環(huán)境微生物

極端環(huán)境(extreme environment)泛指一些類似于深海、極地、冰川、鹽湖、酸性采礦廢水、深海熱液口、溫泉、油田、沙漠、生物腸道等具有低溫、高溫、高壓、高輻射、極酸、極堿、寡營養(yǎng)、高鹽、高重金屬離子濃度等一個(gè)或多個(gè)理化特點(diǎn)的自然或者人工環(huán)境,而能在這些極端環(huán)境中生存的微生物則被稱為極端環(huán)境微生物(extreme environment microorganisms)。雖然極端環(huán)境是地球上的特殊存在,不利于生物體的生存和繁衍,但是極端環(huán)境微生物豐度很高[9],經(jīng)過漫長的自然選擇和適應(yīng)進(jìn)化,能夠在極端環(huán)境中生存、繁殖并穩(wěn)定存在[4]。此外,極端環(huán)境微生物往往具有適合生存在極端環(huán)境的遺傳物質(zhì)和特殊的代謝途徑。這些與眾不同的特點(diǎn)引起了大批學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究者的興趣,全世界范圍內(nèi)的研究者相繼啟動(dòng)了極端微生物及其代謝產(chǎn)物的研究計(jì)劃[10～12],并且取得了很多突破性的進(jìn)展,包括:新物種的發(fā)現(xiàn);新產(chǎn)物、新型極端酶基因的發(fā)現(xiàn);結(jié)構(gòu)與功能及適應(yīng)機(jī)制的研究[13]。

2.2 宏基因組技術(shù)與宏基因組文庫

宏基因組(metagenome)包含環(huán)境中所有微小生物的遺傳物質(zhì)[3]。其最大優(yōu)點(diǎn)在于包含環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的遺傳信息,研究人員可以獲得傳統(tǒng)方式無法提供的基因資源,在絕大程度上能夠避開微生物的分離培養(yǎng),從而進(jìn)行微生物的遺傳信息分析和功能基因的篩選[14～15]。同時(shí),宏基因組包含的信息量很大,研究人員能夠更加全面地研究微生物的復(fù)雜群落結(jié)構(gòu)和功能基因多樣性[5]。通過對宏基因組數(shù)據(jù)的分析和宏基因組文庫的篩選,極端環(huán)境中的大量未培養(yǎng)微生物[16～19]及其功能基因更容易被挖掘。

通過宏基因組獲取酯酶序列的方法主要有以下幾種:1)構(gòu)建宏基因組文庫,再從宏基因組文庫中進(jìn)行活性篩選或者序列篩選;2)利用同源克隆的方法,基于保守序列設(shè)計(jì)兼并引物直接從宏基因組中將片段調(diào)出[20～21],然后通過熱不對稱性交錯(cuò)PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAILPCR)、反轉(zhuǎn)PCR等手段獲得基因全長;3)對基因組樣品直接進(jìn)行測序,再利用生物信息學(xué)的方法從宏基因組中尋找與已知酯酶序列活性區(qū)域相似的讀碼框。

宏基因組文庫主要有BAC文庫、Fosmid文庫、Cosmid文庫、λ Phage文庫、Plasmid文庫、Shotgun文庫等幾種類型。其中,Plasmid文庫主要用于小片段宏基因組文庫的構(gòu)建,而其余幾種則用于較大片段宏基因組文庫的構(gòu)建。目前應(yīng)用于活性物質(zhì)篩選的宏基因組文庫主要為Fosmid文庫和Cosmid文庫。

3 宏基因組方法從極端環(huán)境中獲取酯酶的研究

目前,宏基因組技術(shù)在極端環(huán)境特殊性質(zhì)酯酶的挖掘應(yīng)用中取得了很多可喜的成果(表1)[22～47]。其中,大部分來自宏基因組的酯酶序列都是通過Fosmid文庫的構(gòu)建及功能性篩選獲得。Fosmid作為能夠承載較大片段的載體,在克隆和篩選過程中具有穩(wěn)定性好、拷貝數(shù)可以誘導(dǎo)等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于宏基因組文庫的構(gòu)建和功能基因的篩選。

表1 利用宏基因組技術(shù)從極端環(huán)境挖掘的酯酶Table 1 Esterases excavated from extreme environments using metagenomics

3.1 極端低溫環(huán)境宏基因組來源的酯酶研究

在已報(bào)道的極端環(huán)境宏基因組來源的酯酶中,以深海和極地深海沉積物宏基因組來源的酯酶數(shù)量最多,且很大一部分深海和極地宏基因組來源的酯酶具有耐鹽性、耐堿性、適冷性等特殊的酶學(xué)性質(zhì)[22～35]。Jeon等[23]從冷海沉積物宏基因組中篩選獲得一個(gè)具有酯水解陽性的亞克隆,經(jīng)過測序和比對分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)類似于脂肪酶的開放閱讀框EML1,系統(tǒng)發(fā)育樹顯示EML1屬于新的酯酶家族,進(jìn)一步研究其表達(dá)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)EML1能在5℃時(shí)保持50%以上的活性。De Santi等[26]從北極深海沉積物宏基因組中篩選獲得的酯酶Lip3能夠耐受較寬的溫度范圍,60℃孵育2 h仍能保持80%的活性,在10℃以下能保持45%以上的活性,對二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)和高濃度鹽有很好的耐受性,且在3 mol/L的NaCl中穩(wěn)定性能提高4倍。Lee等[28]從韓國西海岸潮灘沉積物宏基因組中篩選到磷脂酶MPlaG,該酶在pH 5～10能保持85%以上的活性,在pH 4和pH 11條件下殘余酶活仍能達(dá)到20%,在5℃能保持40%以上的酶活。Borchert等[29]從深海海綿體宏基因組中篩選到31個(gè)酯水解陽性克隆,其中活性最高的7N9最適pH為8.0,最適溫度為4～25℃,能夠耐受多種金屬離子和高濃度的NaCl。Gavin等[30]從海洋宏基因組中篩選到的酯酶26D具有優(yōu)良的對映體選擇性,得到的對映體純度高達(dá)98%。Huo等[31]從深海宏基因組中篩選到兩條對金屬離子和表面活性劑有較高抗性的酯酶序列。這些酯酶所表現(xiàn)的耐鹽性、適冷性以及耐堿性等優(yōu)良性質(zhì)很可能與相應(yīng)極端環(huán)境的復(fù)雜物理化學(xué)特征有極大的關(guān)系。另外,還有一些嗜冷酶則來源于其他極端低溫環(huán)境如冰川、多年凍土宏基因組等[27,35]。

3.2 極端高溫環(huán)境宏基因組來源的酯酶研究

一些地?zé)岢练e物、堆肥、深海熱液口或者火山附近的鹵水池沉積物等極端環(huán)境宏基因組來源的酯酶大都具有耐熱的特點(diǎn)[37～38]。Rhee等[37]從溫泉及其沉積物的宏基因組文庫中篩選得到一個(gè)耐熱酯酶基因,該基因與已經(jīng)報(bào)道的超嗜熱古細(xì)菌(Pyrobaculum calidifontis)的基因具有64%的相似性,其表達(dá)產(chǎn)物在pH 4條件下仍能保持40%的酶活,且90℃孵育30 min仍能保持50%的酶活,具有很好的耐熱性。Mohamed等[38]從紅海高溫鹵水池的宏基因組文庫中篩選得到嗜熱耐重金屬酯酶基因EstATII,該酶的最適反應(yīng)溫度為65℃,在4.5 mol/L的NaCl和多種重金屬中仍能保持活性,同時(shí)在30～80℃的溫度范圍內(nèi)其酶活均無明顯影響。Koutsandreas等[39]通過序列篩選從溫泉宏基因組中獲得的酯酶EstDZ4在40～85℃的溫度范圍內(nèi)均能保持較高酶活,在70℃和75℃下孵育24 h,酶的活性仍保持在40%以上。Lu等[41]從堆肥宏基因組中克隆得到耐熱酯酶EST2,其在70～80℃時(shí)的酶活性最高,且在有機(jī)溶劑中仍能保持穩(wěn)定。

3.3 其他極端環(huán)境宏基因組來源的酯酶研究

另外,現(xiàn)有研究還報(bào)道了一些來自于其他極端環(huán)境宏基因組的具有特殊酶學(xué)性質(zhì)的酯酶[42～47]。比如,邵化[42]從造紙廠的活性污泥宏基因組文庫中篩選發(fā)現(xiàn)了耐熱酯酶基因est-XG2,該酶最適pH為8.5,最適反應(yīng)溫度為70℃,能夠耐受較寬的溫度范圍,在20～90℃均能保持較高的酶活性,尤其在90℃仍有70%的殘余酶活。Lewin等[43]從海上油田宏基因組中獲得高度耐熱的酯酶FS02,該酶在pH 11時(shí)活性最高,在80℃下孵育5 h和90℃下孵育1 h仍能檢測到較高的酶活性,同時(shí)熱穩(wěn)定性不受pH影響,并能夠耐受大部分的金屬離子。Zhong等[44]從造紙廠廢水沉積物宏基因組中篩選獲得的酯酶Est906在強(qiáng)堿性條件下(pH 10.0～11.0)具有良好的穩(wěn)定性,在52～62℃的溫度范圍內(nèi)仍能保持85%以上的酶活。Tutuncu等[45]通過設(shè)計(jì)簡并引物從高鹽湖宏基因組中克隆到的酯酶hAGEst在pH 9時(shí)活性最佳,在5℃和10℃時(shí)能保持一半的活性,在55℃條件下孵育20 min時(shí)仍然能穩(wěn)定存在。

4 宏基因組技術(shù)用于極端環(huán)境酯酶挖掘的必要性與面臨的挑戰(zhàn)及其日后發(fā)展方向

4.1 宏基因組技術(shù)用于極端環(huán)境酯酶挖掘的必要性

工業(yè)生產(chǎn)需要酯酶能夠耐受較寬的溫度和pH范圍、有機(jī)溶劑、金屬離子等條件,而醫(yī)藥、食品行業(yè)還需要酯酶具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性[48～54]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,開發(fā)具有這些特性的酯酶的重要性日益凸顯。從目前已報(bào)道的極端環(huán)境來源的酯酶所具有的性質(zhì)來看,酶學(xué)性質(zhì)和來源呈一定的相關(guān)性[55～57]。比如:耐熱酯酶大多來自于溫度比較高的環(huán)境,它們除了能在高溫下保持酶活性和穩(wěn)定性以外,通常還表現(xiàn)出對有機(jī)溶劑、洗滌劑和極端pH的抗性[58～62];耐鹽耐堿的酯酶大部分來自于高鹽高pH的環(huán)境,而適冷性酯酶則大都來自于溫度較低的環(huán)境[63]。對于天然來源的野生型酯酶來說,雖然酯酶的來源與性質(zhì)有相關(guān)性,但是不能完全決定性質(zhì)。極端環(huán)境來源酯酶的這些性質(zhì)的存在,對日后結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究、酯酶分子的改造及定向進(jìn)化、其他酶種的改造等具有重大指導(dǎo)意義[57～64]。通過對酶蛋白的氨基酸序列及高級結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的對應(yīng)規(guī)律進(jìn)行研究和總結(jié),可以對現(xiàn)有的酶序列進(jìn)行改造和定向進(jìn)化,以賦予其人類需要的酶學(xué)性質(zhì)。

4.2 宏基因組技術(shù)用于極端環(huán)境酯酶挖掘面臨的挑戰(zhàn)

目前,宏基因組篩選方法主要有基于序列篩選和基于功能篩選兩種。雖然兩種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),但是無論哪種篩選方法,都不可避免地需要對樣品進(jìn)行宏基因組DNA的提取,而目前的DNA提取手段仍然存在很大的局限性。復(fù)雜的極端環(huán)境導(dǎo)致了多種影響DNA提取的因素的存在[65～66],例如:與DNA緊密結(jié)合的腐殖酸,很大程度上會抑制聚合酶活性,雖然有一些方法能夠減少其含量,但是始終達(dá)不到去除的目的[67];部分特殊極端環(huán)境樣品的DNA提取需要特殊的方法,但是由于DNA提取過程的損耗,通常不能獲得環(huán)境中所有微生物類群的遺傳物質(zhì)[68～69]。

基于功能的篩選方法需要宏基因組文庫的每個(gè)克隆與底物相互作用,再基于平板上底物顏色或渾濁程度(即透明圈法)的變化確定其活性[70～72]。功能篩選的成功往往需要建立在底物能夠溶解、作用前后底物顏色或者透明度能夠發(fā)生變化、功能基因在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠有比較好的表達(dá)水平且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能夠正確折疊和分泌等條件的基礎(chǔ)上,以上條件缺一不可。研究表明,當(dāng)大腸桿菌被當(dāng)作宿主用于宏基因組文庫篩選時(shí),只有大約40%的酶能夠通過功能篩選被回收[72]。這是因?yàn)榇蟛糠謽O端環(huán)境微生物的遺傳背景與宿主細(xì)胞差異很大,篩選過程中很可能由于稀有密碼子、翻譯及遺傳系統(tǒng)等種種因素導(dǎo)致外源基因無法表達(dá)。另外,真菌由于內(nèi)含子的存在,也無法通過功能篩選的方法獲得其功能基因。

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展、可用于大規(guī)模分析的生物信息學(xué)工具的出現(xiàn)以及序列分析和篩選手段的不斷完善,越來越多的研究者通過宏基因組數(shù)據(jù)分析尋找與已知序列同源的序列,或者基于已知序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物并通過PCR的方法挖掘新的酯酶?；谛蛄蟹治龊秃Y選方法的弊端在于無法保證基因(基因簇)的完整性,而且以大量的已知序列及其保守性為基礎(chǔ),與已知序列相似度很低或者全新的序列很難被發(fā)現(xiàn)。與此同時(shí),高通量測序技術(shù)的成本和準(zhǔn)確率仍舊是限制宏基因組學(xué)發(fā)展的重要問題。

4.3 宏基因組技術(shù)用于極端環(huán)境酯酶挖掘的日后發(fā)展方向

宏基因組技術(shù)應(yīng)用于極端環(huán)境的酯酶及其他功能基因的挖掘,其日后的發(fā)展可以從以下幾方面予以重點(diǎn)考慮:1)針對不同的環(huán)境尤其是極端環(huán)境的高質(zhì)量基因組提取方法的建立;2)高精度、高通量、低成本的測序技術(shù)的開發(fā)[73],以提高環(huán)境中低種群豐度的微生物及其功能基因被發(fā)現(xiàn)的可能性;3)宏基因組文庫構(gòu)建系統(tǒng)及表達(dá)系統(tǒng)的更新,這里的主要內(nèi)容在于宏基因組構(gòu)建過程中DNA損耗程度的降低和操作復(fù)雜程度的降低,以及表達(dá)系統(tǒng)中宿主菌的啟動(dòng)子、信號肽、稀有密碼子和翻譯修飾系統(tǒng)的兼容性的改進(jìn);4)篩選精度的提高與新篩選方法的建立,現(xiàn)有的基于功能和序列的篩選方法局限性明顯,且功能性篩選過程中除蛋白質(zhì)無法正確折疊分泌以外,很有可能由于表達(dá)量不足以使底物產(chǎn)生明顯變化而無法被發(fā)現(xiàn);5)針對真菌宏基因組文庫的構(gòu)建及篩選系統(tǒng)的開發(fā),這主要是由于現(xiàn)有的宏基因組文庫的構(gòu)建與篩選技術(shù)通常只適用于細(xì)菌,真菌的基因組因含有較多的內(nèi)含子無法適用,而大多數(shù)真菌來源的酶具有較寬的底物譜以及良好的耐受性[74],其性質(zhì)更加適用于工業(yè)應(yīng)用;6)與宏轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)的聯(lián)用[75],以促進(jìn)微生物和其代謝產(chǎn)物與環(huán)境的關(guān)系及作用機(jī)制的研究;7)與合成生物學(xué)以及生物信息學(xué)展開更深層次的結(jié)合,一方面,宏基因組中已被打斷的DNA片段的重裝以及基于同源性的重新結(jié)合可以獲得更加完整的微生物基因信息;另一方面,基于合成生物學(xué)的手段將完整的遺傳物質(zhì)、代謝通路進(jìn)行重新組合最終能夠得到從頭合成的極端環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物和活性功能性化合物。

5 結(jié)語

傳統(tǒng)的通過微生物分離培養(yǎng)、純菌測序等手段得到微生物基因組和功能基因的方法局限性明顯。宏基因組學(xué)在很大程度上改變了研究者們的研究思路,為極端環(huán)境中未培養(yǎng)微生物來源的酯酶及其他功能基因的研究提供了新的思路和方法。極端環(huán)境是特殊性質(zhì)新型酯酶基因的重要來源,基于宏基因組學(xué)的方法可從中獲得性質(zhì)優(yōu)良且能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)過程中嚴(yán)苛條件的酯酶基因。雖然近年來已有大量的宏基因組數(shù)據(jù)被公布,也有一些來源于極端環(huán)境宏基因組的酯酶被報(bào)道,但仍有大量的潛在資源未被挖掘。

日后,隨著新的宏基因組提取手段的建立、更加靈敏的篩選方法的改進(jìn)、兼容性更好的宏基因組文庫構(gòu)建系統(tǒng)和基因表達(dá)修飾系統(tǒng)的更新、新一代測序技術(shù)以及更加方便的生物信息學(xué)工具的發(fā)展,極端環(huán)境來源的酯酶和其他活性物質(zhì)的數(shù)量將會以更快的速度增加。這些酶蛋白和活性物質(zhì)也將會在人類的生活和工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用。