鐘引鳳，劉曉芳，劉 貝，黃云祥，何慶華，李燕萍，涂 追，劉 瓊，付金衡*

(南昌大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；b.中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；c.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；d.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330031)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是一種螺旋形、微嗜氧、革蘭氏陰性感染性病原體，主要寄生在在人體的胃黏膜上[1]。感染幽門螺桿菌會(huì)帶來各種腸胃道疾病，如胃炎、消化性潰瘍、胃癌等[2,4]，世界上一半的人口遭受了幽門螺桿菌的感染[1]。胃中的尿素酶早在20世紀(jì)就被發(fā)現(xiàn)，且尿素酶被證明具有很高的抗原性被認(rèn)為是開發(fā)預(yù)防和治療性幽門螺桿菌感染疫苗的潛在抗原，有證據(jù)表明尿素酶是幽門螺桿菌感染患者抗體識(shí)別的主要靶點(diǎn)[3]。

目前，基于免疫尿素酶分析檢測(cè)幽門螺桿菌感染的大多是多克隆抗體[15]和單克隆抗體[16]、scFV[17]，但這些抗體存在穩(wěn)定性差、產(chǎn)量少等不足，使用具有分子量低、穩(wěn)定性好、親和力高、易于基因程改造等優(yōu)點(diǎn)的納米抗體檢測(cè)幽門螺桿菌鮮有報(bào)道[5-7]。近年來，納米抗體被廣泛地應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷及治療、藥物開發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域[18-21]。現(xiàn)階段，治療幽門螺桿菌感染的常規(guī)藥是抗生素，盡管在一些臨床實(shí)驗(yàn)中，抗生素治療表現(xiàn)了積極的效率，但遇到復(fù)雜臨床病癥時(shí)的真實(shí)效率仍無法保證[8]。疫苗是防治幽門螺桿菌感染考慮的策略之一，但鑒于其易在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫耐受，限制了幽門螺桿菌疫苗的應(yīng)用，同時(shí)不同的疫苗策略還會(huì)帶來安全性問題[9]。研究者們對(duì)納米抗體的深究，使其在疾病診斷及治療領(lǐng)域的應(yīng)用迅速發(fā)展[10-12]。

本研究聚焦抗UreB納米抗體的應(yīng)用，構(gòu)建抗UreB納米抗體噬菌體免疫文庫，采用免疫親和淘選，從該文庫中獲得了抗幽門螺桿菌UreB納米抗體，通過基因工程技術(shù)獲得了原核表達(dá)的納米抗體，并進(jìn)行了初步功能鑒定。本研究中淘選的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體可以利用納米抗體的高特異性和高親和力，建立一系列簡單、便捷、成本低的檢測(cè)幽門螺桿菌感染的方法，達(dá)到早期預(yù)防和診斷的目的。同時(shí)也可以將抗幽門螺桿菌UreB納米抗體進(jìn)行人源化改造，為以后用做抗體藥物治療幽門螺桿菌感染打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

幽門螺桿菌J99菌液由南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉瓊講師惠贈(zèng)；PCR引物由上海生工合成；EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技有限公司；pET25b、噬菌粒載體pComb3XSS、輔助噬菌體M13KO7為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器

穩(wěn)壓電泳儀(DYY-I Ⅲ)六一儀器廠；酶標(biāo)儀Thermo公司；超聲破碎儀新芝生物科技股份有限公司；PCR儀器BIO-RAD。

1.3 方法

1.3.1 幽門螺桿菌UreB重組蛋白的表達(dá)與鑒定

(1)幽門螺桿菌UreB基因的擴(kuò)增和TA克隆

根據(jù)NCBI上AY714224.1的UreB基因序列和pET25b載體設(shè)計(jì)引物：UreB-F1：5′-GGAATTCCAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3′(EcoRI)

UreB-R1：5′-CCAAGCTTGGGAAAATGCTAAAGAGTTGCGC-3′(HindIII)。以幽門螺桿菌J99菌液為模板，PCR反應(yīng)條件為94 ℃(預(yù)變性)：5 min，94 ℃(變性)：1 min，55 ℃(退火)：1 min，72 ℃(延伸)：2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃：10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，根據(jù)Mighty TA-cloning Kit進(jìn)行TA克隆，電轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)中，菌落PCR驗(yàn)證克隆并送至擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

分別將UreB基因和pET25b載體用EcoRI和HindIII雙酶切酶連后電轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)中，菌落PCR驗(yàn)證克隆并測(cè)序。將序列正確的陽性克隆電轉(zhuǎn)至E.coliRosetta感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在2×YT-amp平板中，取單個(gè)菌接于5 mL LB-amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r·min-1過夜培養(yǎng)按1%接種于50 mL LB-amp液體培養(yǎng)基中，220 r·min-137 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4左右，加入0.2 mmol·L-1IPTG 25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收集菌體，超聲破碎后收集上清和沉淀，SDS-PAGE鑒定。

(3)重組蛋白的變性、純化及復(fù)性

收集目的蛋白包涵體沉淀，用包涵體洗滌液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.5% Triton X-100)洗3次，加入適量體積的變性液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素)，4 ℃，水平搖床放1 h，離心取上清，Ni-柱純化，將含目的蛋白且純度較高的洗脫液，每間隔4 h加入等體積的包涵體復(fù)性液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl，1.5 mmol·L-1GSH，0.3 mmol·L-1GSSG，0.5 mol·L-1精氨酸)以逐步稀釋尿素濃度，再經(jīng)10 kDa微量透析管透析,測(cè)蛋白濃度蛋白定量。

1.3.2 羊駝免疫及血清效價(jià)測(cè)定

將4×108cfu滅活的HpJ99菌與相同體積弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，每隔2周，取2×108cfu滅活的幽門螺桿菌J99菌與等體積弗氏不完全佐劑乳化進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取3次加強(qiáng)免疫的羊駝血測(cè)血清效價(jià)。方法如下：100 μL濃度為5 μg·mL-1重組蛋白UreB，于4 ℃冰箱中包被12 h；PBST溶液洗滌3次后，4%的脫脂牛奶于37 ℃中封閉1 h；PBST溶液洗滌3次后，梯度稀釋后的羊駝血清于37 ℃中結(jié)合30 min；PBST溶液洗滌3次后，加入100 μL 1/5000的HRP標(biāo)記鼠抗羊駝的抗體稀釋液，于37 ℃孵育30 min；PBST溶液洗滌6次后，加入100 μL TMB單組份顯色液，于37 ℃中顯色10 min；最后加入2 moL·L-1H2SO4終止液，酶標(biāo)儀測(cè)OD450值。

1.3.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建

具體方法參考文獻(xiàn)[13]，簡單描述為：從羊駝血液中獲取總RNA，根據(jù)Thermo公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，通過two-step nested PCR方法獲得VHH基因，第一步反應(yīng),使用alpVh-LD(5′-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3′)和CH2-R(5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′)一對(duì)引物，擴(kuò)增出約700 bp的VH域；第二步反應(yīng)，使用VHH-1(5′-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3′)和VHH-2(5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′)或VHH-3(5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3′)兩對(duì)引物PCR出約500 bp的VHH基因。分別用SfiI酶切VHH基因和噬菌粒載體pComb3XSS，酶連后轉(zhuǎn)化至E.coliTG1感受態(tài)里，過夜固體培養(yǎng)后，以1/20的感染復(fù)數(shù)感染M13KO7輔助噬菌體，建抗Hp UreB納米抗體的噬菌體文庫，并通過插入率和庫容及多樣性鑒定評(píng)估文庫質(zhì)量。

1.3.4 抗Hp納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

采用固相免疫親和淘選，以重組蛋白UreB為抗原，從建的納米抗體噬菌體庫中篩選出能特異性結(jié)合UreB的納米抗體。具體方法參照文獻(xiàn)[14]，按表1條件進(jìn)行三輪篩選，每一輪篩選后，取10 μL洗脫物測(cè)滴度，剩余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。

表1 淘選條件

1.3.5 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

分別從第2、3輪洗脫物測(cè)滴度的平板上(選取菌落數(shù)100～300個(gè)的平板)，隨機(jī)挑取48個(gè)克隆子，進(jìn)行單個(gè)噬菌體克隆的救援[14]，根據(jù)OD450樣本值/OD450陰性對(duì)照值≥2時(shí)，視為陽性克隆，并進(jìn)行特異性驗(yàn)證及測(cè)序。

1.3.6 抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體的原核表達(dá)

(1)表達(dá)載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36的構(gòu)建

分別以pComb3XSS-HU2-9、pComb3XSS-HU2-36質(zhì)粒為模板，根據(jù)EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書設(shè)計(jì)擴(kuò)增VHH基因的F′(5′-AGCCGGCGATGGCCATGCAGGTGCAGCTCGTGGATGC-3′)和R′(5′-ATCTCGAGTGCGGCCGCCTGGCCGGCCTGGCCGTCTTG-3′)引物，PCR擴(kuò)增出VHH基因，表達(dá)載體pET25b(+)進(jìn)行NcoI和NotI雙酶切，按EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書配制連接體系，混合反應(yīng)液置于50 ℃反應(yīng)15 min，瞬時(shí)離心并置于冰上冷卻，鈣轉(zhuǎn)至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于2×YT-amp平板篩選陽性克隆，隨機(jī)挑取克隆子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并測(cè)序。

(2)抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將陽性克隆培養(yǎng)至OD600約0.5時(shí)，在30 ℃，220 r·min-1，加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG搖床培養(yǎng)6 h后，收集菌體，超聲破碎后將含有目的蛋白的上鎳柱純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

1.3.7 間接ELISA鑒定抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體結(jié)合Hp的活性

具體方法參考文獻(xiàn)[14]，簡單概括為包被3 μg·mL-1的幽門螺桿菌全菌蛋白，結(jié)合時(shí)加入不同濃度的納米抗體，測(cè)OD450，根據(jù)OD450樣本值/OD450空白對(duì)照值≥2時(shí)，即認(rèn)為納米抗體在該濃度下具有結(jié)合幽門螺桿菌的能力。

1.3.8 抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體抑制尿素酶活性鑒定

具體方法參考文獻(xiàn)[4]，通過在一定時(shí)間內(nèi)，測(cè)定CO2濃度的變化，評(píng)估納米抗體中和幽門螺桿菌尿素酶活性的能力，即體外培養(yǎng)幽門螺桿菌至109cfu，然后與不同濃度的納米抗體于4 ℃下孵育16 h，加入100 μL 500 mmol·L-1尿素和0.2 g·L-1的酚紅混合液于37℃下孵育3 h，在這3 h內(nèi)，每30 min，測(cè)定OD550，通過公式計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 幽門螺桿菌UreB重組蛋白的表達(dá)與鑒定

2.1.1 幽門螺桿菌UreB基因的擴(kuò)增

利用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)顯示在大約1 700 bp左右有一條清晰的條帶，其大小與幽門螺桿菌UreB基因理論分子量大小(1 710 bp)相近，成功擴(kuò)增到幽門螺桿菌UreB基因片段，具體見圖1。

M:DNA marker,1:PCR產(chǎn)物UreB。

2.1.2 幽門螺桿菌UreB蛋白表達(dá)及純化

重組pET25b-UreB質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至E.coliRosetta感受態(tài)細(xì)胞中，0.2 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)純化后，SDS-PAGE電泳鑒定誘導(dǎo)后的表達(dá)情況，從圖2可得UreB基因在該原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，UreB重組蛋白分子量大小約66 kDa與理論值相符，復(fù)性后獲得高純度的目的蛋白。

2.2 羊駝免疫后血清效價(jià)的測(cè)定

將滅活的幽門螺桿菌J99菌株免疫羊駝4次，分別取第2，3，4次免疫羊駝后的血清并以免疫之前的血清作為陰性對(duì)照，倍比稀釋免疫羊駝前后的血清，以重組蛋白UreB為抗原，間接ELISA法測(cè)效價(jià)如圖3所示。隨著免疫次數(shù)的增加免疫反應(yīng)隨之增強(qiáng)，特異性的抗體增多，菌體展示文庫，有利于淘選出特異性好、親和力高的納米抗體。

M:蛋白marker；1～4:復(fù)性前用不同濃度咪唑洗脫的蛋白；5:復(fù)性后重組蛋白UreB。

K

2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建

采取羊駝血30 mL，提取總RNA，如圖4(a)所示，可清晰的看到總RNA的18S和28S兩條帶。兩步巢式PCR擴(kuò)增VHH基因，第一步巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定如圖4(b)所示，750 bp左右出現(xiàn)長鉸鏈重鏈抗體編碼的可變區(qū)基因。第二步反應(yīng)以第一步回收純化后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物如圖4(c)所示。

(a):提取的總RNA,M:DNA marker DL2000,1:總RNA；(b):第一輪巢式PCR,M:DNA marker,1-2:兩對(duì)引物的PCR產(chǎn)物,目的條帶約為750 bp；(c):第二輪巢式PCR,M:DNA marker；1-2:兩對(duì)引物的PCR產(chǎn)物，目的條帶約為750 bp。

在450 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期擴(kuò)增的VHH片段大小相符的條帶，純化PCR產(chǎn)物將其與噬菌粒載體pComb3XSS分別進(jìn)行SfiI酶切，T4 DNA酶連接后電轉(zhuǎn)至E.coliTG1感受態(tài)中，37 ℃固態(tài)過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑24個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，如圖5(a)所示，在650 bp左右有條帶，計(jì)算得VHH基因插入率為87.5%，將陽性克隆送測(cè)序，多序列比對(duì)結(jié)果如圖5(b)所示，21個(gè)陽性克隆的基因均為編碼VHH的基因序列抗體庫的有效庫容達(dá)到4.68×107cfu。

2.4 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

以重組蛋白UreB為靶分子，經(jīng)過3輪固相親和淘選，每輪以“吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增”為主要步驟，逐輪降低靶分子包被濃度、文庫投入量，增加洗滌次數(shù)來富集特異性結(jié)合UreB的納米抗體，結(jié)果如表2所示，噬菌體克隆得到有效富集。

表2 各輪淘選中結(jié)合UreB的噬菌體克隆的滴度和富集度

(a):菌落PCR,M:DNA marker；1-24:隨機(jī)挑選的菌落；(b):alignment的比對(duì)序列。

2.5 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

通過間接ELISA檢測(cè)從測(cè)洗脫噬菌體滴度的平板上隨機(jī)挑取的48個(gè)噬菌體克隆救援后的上清[14]，根據(jù)OD450樣本值/OD450陰性對(duì)照值≥2即為陽性噬菌體，選取吸光度較高的11個(gè)陽性噬菌體進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示11個(gè)陽性噬菌體特異性都較好。序列測(cè)定后，采用alignment軟件進(jìn)行多序列對(duì)比分析，得到了6種不同的獨(dú)特納米抗體基因序列，序列分析發(fā)現(xiàn)HU2-9和HU2-36 CDR3區(qū)長度適中且無半胱氨酸易表達(dá)，故用這兩個(gè)納米抗體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 納米抗體的原核表達(dá)

2.6.1 表達(dá)載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36的構(gòu)建陽性克隆的菌落PCR鑒定結(jié)果如圖7所示，在750 bp處出現(xiàn)目的條帶，陽性克隆測(cè)序結(jié)果表明，表達(dá)載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36構(gòu)建成功。

Phage Clones

M:DNA marker；12:HU2-9重組克隆；13-22:HU2-36重組克?。?3:陰性對(duì)照；24:空白對(duì)照。

2.6.2 納米抗體的表達(dá)與純化

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，0.1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，超聲破碎后收集上清，Ni柱純化后SDS-PAGE鑒定純化效果，結(jié)果如圖8表明，在20 kDa處有蛋白條帶，符合目的蛋白分子量大小，經(jīng)BCA方法定量后，算出重組蛋白表達(dá)量分別為92和32 mg·L-1。

M:蛋白marker,1-3:分別為20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑下洗脫的HU2-9蛋白；4-6:分別為20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑下洗脫的HU2-36蛋白。

2.7 納米抗體HU2-9、HU2-36結(jié)合幽門螺桿菌的活性分析

間接phage-ELISA分析表達(dá)的納米抗體活性，以破碎的幽門螺桿菌全菌蛋白為檢測(cè)抗原，分別測(cè)定不同濃度的納米抗體HU2-9和HU2-36結(jié)合幽門螺桿菌的活性，根據(jù)OD450樣本值/OD450空白對(duì)照值≥2即認(rèn)為具有結(jié)合幽門螺桿菌全菌蛋白的能力，結(jié)果如圖9表明，只有納米抗體HU2-9在濃度為112.5 μg·L-1時(shí)，才能與幽門螺桿菌全菌蛋白結(jié)合。

2.8 納米抗體HU2-9、HU2-36中和幽門螺桿菌尿素酶活性分析

不同濃度的納米抗體與109cfu幽門螺桿菌J99菌株孵育，通過檢測(cè)一定時(shí)間內(nèi)，CO2濃度的變化，分析抗UreB納米抗體抑制尿素酶活性的影響，如圖10所示，當(dāng)納米抗體濃度在30 μg·mL-1時(shí)，通過計(jì)算HU2-9、HU2-36抑制率分別為18.7%，15.6%，跟Leila Safaee Ardekani淘選出的納米抗體在30 μg·mL-1，抑制率為25%相比具有一定的差異[15]。

Nanobody Concention/(μg·mL-1)

Nanobody Concention/(μg·mL-1)

3 討論

本研究通過將滅活的HpJ99菌皮下多點(diǎn)注射免疫羊駝，經(jīng)過4次免疫成功地構(gòu)建抗UreB納米抗體噬菌體免疫文庫，利用固相免疫親和淘選，從文庫中成功得淘選出了6種不同序列的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體。用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了pET25b(+)原核表達(dá)載體，經(jīng)金屬Ni螯合層析柱純化獲得了較高純度的可溶性重組蛋白。通過間接ELISA對(duì)納米抗體中和幽門螺桿菌尿素酶活性分析，發(fā)現(xiàn)納米抗體能夠一定程度地抑制幽門螺桿菌。本研究中淘選的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體可以利用納米抗體的高特異性和高親和力，建立一系列簡單、便捷、成本低的幽門螺桿菌感染的檢測(cè)方法，達(dá)到早期預(yù)防和診斷的目的。同時(shí)也可以將抗幽門螺桿菌UreB納米抗體進(jìn)行人源化改造，為以后用做抗體藥物治療幽門螺桿菌感染打下良好基礎(chǔ)。