生殖道衣原體質(zhì)粒功能的研究進(jìn)展

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(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省衡陽市 421001； 2.德州大學(xué)圣安東尼奧健康科學(xué)中心 微生物免疫與分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，美國德克薩斯州 78229)

衣原體是一種特殊的細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，具有雙相發(fā)育周期，在細(xì)胞外表現(xiàn)為具有傳染性的原體(elementary bodies,EB)，在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為代謝活躍的網(wǎng)狀體(reticulate bodies,RB)[1]。衣原體屬目前公認(rèn)的有11個(gè)種[2]，其感染的宿主范圍廣泛，能引起人類和動(dòng)物的多種疾病。其中，沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)可引起女性感染者的宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎等，感染反復(fù)遷延，引發(fā)輸卵管慢性炎癥，并繼發(fā)管腔粘連、狹窄甚至閉鎖，形成輸卵管積水，最終導(dǎo)致輸卵管阻塞性不孕，給廣大女性和家庭帶來沉重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。用鼠衣原體(Chlamydia muridarum,Cm)在小鼠構(gòu)建生殖道感染的模型是目前研究Ct與宿主生殖道相互作用的常規(guī)方法[4]。這類與生殖道感染致病有關(guān)的衣原體通常包含有衣原體重要的毒力物質(zhì)——質(zhì)粒[5]。質(zhì)粒除了與衣原體的毒力和致病性有關(guān)外，還對衣原體自身生長代謝、誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答作用均具有影響。本文對生殖道衣原體質(zhì)粒的主要功能及其潛在應(yīng)用價(jià)值作一概述。

1 衣原體質(zhì)粒的基本特征

質(zhì)粒是細(xì)菌中除染色體DNA外能自主復(fù)制的DNA分子。衣原體的質(zhì)粒為環(huán)狀雙鏈DNA，大小約為7.5 kb，存在于染色體外，質(zhì)粒在衣原體RB二分裂階段能達(dá)到最多拷貝數(shù)，以便將質(zhì)粒有效分配于子代衣原體中[6]。生殖道衣原體為非接合性質(zhì)粒，不編碼衣原體抗生素耐藥性，且不具備整合能力[7]。Szabo等[8]發(fā)現(xiàn)，所有衣原體的祖先均攜帶質(zhì)粒，隨著時(shí)間的推移質(zhì)粒會(huì)產(chǎn)生不同的變異。但是，不同衣原體的質(zhì)粒，遺傳相似性為69%～99%[7]。Cm與Ct感染人體的D型菌株有超過90%的基因相似性，兩種衣原體質(zhì)?；蚓蟹蔷幋aRNA與8個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)，分別編碼8個(gè)質(zhì)粒蛋白pGP1-8[9-10]。小鼠陰道接種Cm導(dǎo)致的生殖道感染也與Ct在女性生殖道引起的感染非常相似。因此，Cm的質(zhì)粒功能在某種程度上可以反映Ct的質(zhì)粒功能。

2 衣原體質(zhì)粒的致病性

隨著小鼠模型和質(zhì)粒缺失株的應(yīng)用，衣原體質(zhì)粒在致病性方面的研究有了新的進(jìn)展。Hou等[11]比較了Cm質(zhì)粒缺失株與質(zhì)粒攜帶株在BALB/c小鼠中的感染情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)陰道接種Cm質(zhì)粒攜帶株的小鼠出現(xiàn)輸卵管積水，而接種Cm質(zhì)粒缺失株的小鼠未出現(xiàn)明顯病變；甚至將Cm質(zhì)粒缺失株直接注射到小鼠輸卵管內(nèi)依舊不能誘發(fā)輸卵管積水；同樣，Ct質(zhì)粒缺失株在小鼠泌尿生殖道中的感染力及毒力與質(zhì)粒攜帶株相比也顯著降低[12]。這些結(jié)果表明，質(zhì)粒在衣原體的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能與衣原體引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)并誘發(fā)輸卵管病變顯著相關(guān)。此外，質(zhì)粒在衣原體定植胃腸道時(shí)也發(fā)揮重要作用。Cm能夠感染小鼠生殖道，然后通過血液途徑傳播至胃腸道，Shao等[13]發(fā)現(xiàn)與質(zhì)粒攜帶株相比，Cm質(zhì)粒缺失株接種小鼠生殖道后擴(kuò)散并定植于胃腸道的時(shí)間明顯延遲，且胃腸道的衣原體載量顯著減少，甚至通過靜脈接種或胃部接種也不能使Cm質(zhì)粒缺失株正常定植于胃腸道，因此質(zhì)粒還可能在衣原體生殖道感染向胃腸道擴(kuò)散、定植過程中發(fā)揮重要作用。Ma等[14]通過將Cm質(zhì)粒攜帶株與質(zhì)粒缺失株感染小鼠胃腸道不同部位發(fā)現(xiàn)質(zhì)?；蛟S能夠通過不同的機(jī)制提高衣原體在腸道不同位置的適應(yīng)性。

衣原體質(zhì)粒的8個(gè)ORF編碼8個(gè)質(zhì)粒蛋白(pGP1-8)，其中pGP3是唯一的分泌蛋白。研究者在Cm感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)pGP3是衣原體誘發(fā)輸卵管炎癥及阻塞的重要毒力因子[15-16]。Ramsey等[17]也發(fā)現(xiàn)pGP3缺乏的Ct L2型感染小鼠生殖道后引發(fā)炎癥反應(yīng)的能力減弱。除生殖道外，Cm也能感染小鼠腸道并實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的定植[18]，文獻(xiàn)[19-20]使用pGP3缺失的Cm經(jīng)不同途徑感染小鼠，發(fā)現(xiàn)pGP3能夠使衣原體通過胃黏膜屏障從而定植于胃腸道。Huo等[21]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，僅缺乏pGP3的衣原體或許能夠激活腸道對衣原體傳播的調(diào)控。在衣原體感染過程中，EB會(huì)暴露在細(xì)胞外的黏膜環(huán)境中，許多黏膜效應(yīng)因子對EB具有殺傷作用，pGP3能夠抑制多種效應(yīng)因子的抗衣原體活性從而使子代EB安全地感染下一個(gè)宿主細(xì)胞，例如，在小鼠和非人類靈長類動(dòng)物感染模型中，被感染的輸卵管上皮細(xì)胞裂解的細(xì)胞質(zhì)中釋放的pGP3能夠抑制抗菌肽對衣原體的殺傷作用，通過靶向作用于抗菌肽，破壞固有免疫從而實(shí)現(xiàn)衣原體的持續(xù)性感染。該結(jié)果證明pGP3對衣原體有效免疫逃逸，并在宿主建立持續(xù)性感染中至關(guān)重要[22-24]。Ct能夠通過多種機(jī)制調(diào)控宿主細(xì)胞死亡的信號通路，以確保完成自身生長周期，例如，Lei等[25]發(fā)現(xiàn)Ct的pGP3或許能夠上調(diào)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達(dá)調(diào)控線粒體的自噬與凋亡，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。Zou等[26]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT介導(dǎo)的MDM2-p53通路的激活在抵抗Ct感染引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，而Ct的pGP3能夠作用于該通路從而抑制HeLa細(xì)胞凋亡。

Song等[9]發(fā)現(xiàn)，pGP4是pgp3與多種染色體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包括糖原合成酶基因glgA。由于pGP4缺失導(dǎo)致pgp3等多種基因表達(dá)改變，因此很難確定pGP4除了調(diào)控表達(dá)外的其他功能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒缺失的Ct L2血清型刺激宿主產(chǎn)生炎癥因子的能力降低，但不能確定該性狀的出現(xiàn)是由于缺失pGP3或者pGP4的結(jié)果[27]。此外，擁有質(zhì)粒的衣原體能夠向鄰近細(xì)胞擴(kuò)散，而無質(zhì)粒的L2血清型衣原體只能產(chǎn)生滯留在細(xì)胞內(nèi)的包涵體。該性狀可能是由于pGP4的缺失造成[28]。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)pGP4能夠通過作用于EUO調(diào)控衣原體RB到EB的轉(zhuǎn)變，從而調(diào)控衣原體轉(zhuǎn)錄過程。

缺失pGP5的Ct L2血清型不會(huì)明顯影響其受質(zhì)粒調(diào)控的染色體基因的表達(dá)，將Cm的pgp5基因敲除或替換為mCherry基因，導(dǎo)致受質(zhì)粒調(diào)控的基因表達(dá)顯著增高，包括tc0319，tc0181，tc0419，tc0420，tc042以及tc0357[30]。這些結(jié)果表明pGP5可能是Cm的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而這些基因受到pGP4的正向調(diào)節(jié)。

過去研究者認(rèn)為pGP8對于質(zhì)粒的維持有重要作用[9]。Gong等[31]發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒在L2型的Ct中依然維持穩(wěn)定，證實(shí)維持質(zhì)粒所必需的是pgp8基因序列而不是pGP8蛋白。此外，pgp8基因還編碼一種反義小RNA，命名為sRNA-2。在所有Ct質(zhì)粒ORF中，sRNA-2的表達(dá)最為豐富，表明sRNA-2在調(diào)節(jié)pgp8中發(fā)揮重要作用[32]。

pGP7的缺失在Ct L2型和Cm中都沒有引起任何顯著差異。此外，pGP7缺失的Cm誘導(dǎo)的輸卵管積水與Cm質(zhì)粒完整株誘導(dǎo)的輸卵管積水同樣嚴(yán)重。因此，pgp7缺失的衣原體可以作為致病機(jī)理研究的對照菌株。另外，由于pgp1、pgp2或pgp6基因的缺失會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒的維持功能受到影響，因此難以評價(jià)它們在衣原體致病性中的作用[31]。

3 質(zhì)粒對衣原體生長周期的影響

質(zhì)粒能夠通過調(diào)節(jié)染色體基因的表達(dá)從而影響衣原體的生長周期。Skilton等[33]通過比較攜帶質(zhì)粒與無質(zhì)粒的Cm在McCoy細(xì)胞中的生長性狀及包涵體形態(tài)，證實(shí)了質(zhì)粒缺失是影響衣原體生長及其染色體基因復(fù)制的重要原因。Gong等[31]發(fā)現(xiàn)Ct和Cm質(zhì)粒可調(diào)節(jié)衣原體多個(gè)染色體基因的轉(zhuǎn)錄，Ct質(zhì)粒缺失導(dǎo)致糖原合成基因表達(dá)下降，使包涵體缺乏對于衣原體生存具有重要意義的糖原積累，表明質(zhì)?？赡芡ㄟ^調(diào)控基因表達(dá)影響衣原體生長。Yang等[34]構(gòu)建了質(zhì)粒pGP1-8基因缺失的Ct L2型轉(zhuǎn)化株，通過進(jìn)行空斑形成實(shí)驗(yàn)和衣原體釋放抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衣原體空斑形成能力依賴于pGP4，通過pGP4調(diào)控F肌動(dòng)蛋白的解聚促進(jìn)衣原體釋放，從而啟動(dòng)新的感染周期，最終引起空斑形成。

4 衣原體質(zhì)粒的應(yīng)用價(jià)值

研究者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無質(zhì)粒衣原體菌株可作為潛在的衣原體減毒活疫苗，預(yù)防衣原體感染引起的病變[31]。O’Connell等[35]利用小鼠模型對Cm質(zhì)粒缺失株的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)接種了Cm質(zhì)粒缺失株的小鼠未發(fā)生生殖道病變，且再次感染野毒株時(shí)，小鼠產(chǎn)生了相應(yīng)的保護(hù)性免疫。以Ct L2型的質(zhì)粒缺失株陰道感染小鼠，發(fā)現(xiàn)其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了針對衣原體的保護(hù)性免疫，該作用不會(huì)引起小鼠輸卵管病變，且小鼠再次感染衣原體野毒株時(shí)陰道感染載量顯著降低[36]。以上結(jié)果均證明無質(zhì)粒衣原體菌株有望發(fā)展為有效的減毒活疫苗。

此外，將質(zhì)粒編碼的免疫優(yōu)勢抗原pGP3免疫小鼠后，可使小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫[17]。人血清抗體通過pGP3的三聚體結(jié)構(gòu)識別該蛋白，該結(jié)構(gòu)由一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)三螺旋中間結(jié)構(gòu)域(pGP3m)組成，該結(jié)構(gòu)可能使pGP3在衣原體引起的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，使得pGP3或許能夠成為潛在的衣原體疫苗[37]。

5 總 結(jié)

質(zhì)粒是否含有與表型有關(guān)的功能基因決定了質(zhì)粒的功能。衣原體質(zhì)粒編碼多種毒力因子，同時(shí)也調(diào)節(jié)衣原體染色體中基因的表達(dá)，使得質(zhì)粒在衣原體中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，促進(jìn)衣原體以更好的生存優(yōu)勢和抗脅迫能力應(yīng)對外界環(huán)境。對質(zhì)粒ORF功能的進(jìn)一步研究不僅能夠促進(jìn)對衣原體致病機(jī)制的了解，更能加速衣原體疫苗研究的進(jìn)展。隨著衣原體生物學(xué)和各種基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們將更加全面深入地了解衣原體致病的分子機(jī)制，從而使生殖道衣原體的質(zhì)粒在其疫苗研制及應(yīng)用中發(fā)揮更大的效益，并研制出衣原體感染的靶向治療方法，更好地造福人類健康。