ERK信號(hào)通路介導(dǎo)的EP300過(guò)表達(dá)在苯腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用*

黃麗欣，彭波輝，彭 昌△，馮玉松，羅孝美，吳書琪，張煥婷

（遵義醫(yī)科大學(xué)1附屬醫(yī)院兒內(nèi)一科，2第一臨床學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，貴州遵義563000）

病理性心肌肥厚是引起心臟衰竭和心源性猝死的重要原因。近年來(lái)病理性心肌肥厚發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，且防治措施尚不完善［1］，因此尋找新的治療手段成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本課題組前期研究證實(shí)組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c了苯腎上腺素（phenylephrine，PE）所致的病理性心肌肥厚，且進(jìn)一步證實(shí)組蛋白乙酰化酶抑制劑漆樹酸（anacardic acid，AA）能夠逆轉(zhuǎn)PE所致的心肌肥厚［2］，但該過(guò)程的上游信號(hào)通路并不清楚。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是MAPKs家族中的一個(gè)主要成員［3］。研究顯示，ERK通路在細(xì)胞分化、增殖、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中起著重要調(diào)節(jié)作用，且該通路可通過(guò)上調(diào)組蛋白H3乙?；?，參與酒精暴露所致的心臟發(fā)育相關(guān)基因過(guò)表達(dá)，提示該通路可能與組蛋白乙?；揎検Ш饨閷?dǎo)的心肌肥厚相關(guān)［4］。因此，本研究應(yīng)用PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大模型，探討ERK信號(hào)通路在組蛋白乙?；敢种苿〢A改善PE誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用，為心肌肥厚的防治提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)新生3 d的健康昆明小鼠120只，體重2.3～2.7 g，雌雄不限，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（渝）2012-0015。

2 主要試劑與儀器

ERK抑制劑U0126、膠原酶Ⅱ和PE（Sigma）；胎牛血清（Gibco）；抗ERK及p-ERK單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；抗第9位賴氨酸乙?；慕M蛋白H3（acetylated histone H3 at lysine 9，H3K9ac）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）和E1A結(jié) 合 蛋 白p300（E1A-binding protein p300，EP300）單克隆抗體及兔IgG多克隆抗體（Abcam）；抗Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG熒光Ⅱ抗（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；抗α-actin及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗（Proteintech）；Trizol總RNA提取試劑（BioTeke）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（Beyotime）；免疫共沉試劑盒（Beaver）。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)選取出生3 d的昆明小鼠，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子及眼科剪取出心臟，輕柔擠出心臟中的血，預(yù)冷PBS液洗凈殘血，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，加入少許0.05%膠原酶Ⅱ反復(fù)吹打消化2 min，放置沉淀后，棄上清液，如此反復(fù)，直至消化完全。將收集的上清液離心（240×g、10 min），棄上清，沉淀與4 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中差速培養(yǎng)90min后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為0.1 mmol/L的BrdU后繼續(xù)培養(yǎng)。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞干預(yù)各組藥物濃度參照文獻(xiàn)［5-7］選取，采用PE干預(yù)心肌細(xì)胞48 h構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型后，按隨機(jī)數(shù)字表法將心肌細(xì)胞分為正常（normal）組（不給予任何處理）、生理鹽水（normal saline，NS）組（給予等量NS處理細(xì)胞）和PE組（用100 μmol/L PE干預(yù)心肌細(xì)胞48 h），探討PE干預(yù)的小鼠心肌細(xì)胞中EP300和H3K9ac的表達(dá)水平及其相互調(diào)控關(guān)系。再將心肌細(xì)胞分為NS組、溶劑對(duì)照（DMSO+PE）組（用100μmol/L PE加等體積的DMSO處理心肌細(xì)胞）、PE組、AA+PE組（用50μmol/L AA處理后加入100μmol/L PE處理心肌細(xì)胞）、U0126+PE組（用10μmol/L U0126干預(yù)后加入100μmol/L PE處理心肌細(xì)胞）和AA+U0126+PE組（用50μmol/L AA孵育心肌細(xì)胞30 min后，再加入10μmol/L U0126處理，最終用100μmol/L PE干預(yù)心肌細(xì)胞48 h），進(jìn)一步探討ERK信號(hào)通路介導(dǎo)的EP300過(guò)表達(dá)在PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用。

3.3 Western blot檢測(cè)提取心肌細(xì)胞蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜浸泡于封閉液中，分別加入兔來(lái)源單克隆抗體H3K9ac、EP300、β-MHC、ERK和p-ERK，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗滌，每次5 min，洗滌6次，然后加入Ⅱ抗孵育，搖床上孵育1 h，TBST洗滌，每次5 min，洗滌6次，使用化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光顯影。采用Bio-Rad圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描；應(yīng)用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行分析。

3.4 RT-qPCR檢測(cè)引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)由寶生物公司合成。將β-MHC產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，運(yùn)用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴(kuò)增，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到R2值和擴(kuò)增效率。β-MHC的上游引物序列為5′-CAAAGGCAAGGCAAAGAAAG-3′，下游引物序列為5′-GCAGAGGCACCAAAATGAAT-3′，產(chǎn)物大小為113 bp；β-actin的上游引物序列為5′-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3′，下游引物序列5′-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3′，產(chǎn) 物 大 小 為289 bp。反應(yīng)條件為：94℃30 s；94℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照，所得數(shù)據(jù)用PCR儀自帶的基于Pfaffl原理的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析軟件處理。

3.5 免疫共沉淀移去培養(yǎng)液，PBS清洗，用結(jié)合緩沖液（含蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，充分混勻后置于冰上孵育10 min，低溫（4℃）20 000×g離心10 min，收集上清。將磁珠預(yù)處理后，分別加入EP300抗體和H3K9ac抗體，室溫翻轉(zhuǎn)20 min，棄上清，加入緩沖液洗滌2次后，加入抗原4℃翻轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。將抗原吸附后的磁體/抗體/抗原復(fù)合物經(jīng)磁性分離，再洗滌，棄掉上清，加入5×SDS-PAGELoading Buffer混合均勻，95℃加熱5 min，室溫下18 000×g離心10 min，收集上清液進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

3.6 免疫熒光檢測(cè)制作細(xì)胞爬片，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，每次5 min，洗滌3次，0.3%Triton X-100室溫孵育15 min，PBS洗滌，每次5 min，洗滌3次，室溫下山羊血清封閉30 min，加入抗α-actin（1∶50）4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min，Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGⅡ抗（1∶1 000），室溫避光孵育1.5 h，PBS洗滌3次，每次5 min，再加入抗EP300Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min，孵育Ⅱ抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI染核5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，抗熒光淬滅劑封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察，應(yīng)用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PE干預(yù)的小鼠心肌細(xì)胞中EP300和H3K9ac的表達(dá)水平及其相互調(diào)控關(guān)系

Western blot結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞中，PE組EP300和H3K9ac表達(dá)水平顯著高于NS組（P＜0.05），見圖1A、B。免疫共沉淀結(jié)果顯示，EP300可特異性與H3K9ac相互結(jié)合，見圖1C。

2 各組小鼠心肌細(xì)胞中ERK和p-ERK的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞中，ERK表達(dá)水平在各組心肌細(xì)胞中無(wú)顯著差異（P＞0.05），而p-ERK的表達(dá)水平在PE組顯著高于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.05）；而ERK抑制劑和AA干預(yù)組的p-ERK水平均顯著低于PE組（P＜0.05），見圖2。

3 各組小鼠心肌細(xì)胞中H3K9ac水平

Western blot結(jié)果顯示，在小鼠心肌細(xì)胞中，PE組H3K9ac水平顯著高于NS組（P＜0.05）；而ERK抑制劑和AA干預(yù)組H3K9ac的水平均顯著低于PE組（P＜0.05），見圖3。

4 各組小鼠心肌細(xì)胞中組蛋白乙?；窫P300的表達(dá)水平

免疫熒光及Western blot結(jié)果表明，在培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞中，PE組EP300表達(dá)水平顯著高于NS組（P＜0.05）；AA及ERK抑制劑干預(yù)組EP300的表達(dá)水平顯著低于PE組（P＜0.05），見圖4。

5 ERK信號(hào)通路在AA逆轉(zhuǎn)PE誘導(dǎo)心肌肥大標(biāo)志物β-MHC過(guò)表達(dá)中的作用

RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示，PE組心肌肥大標(biāo)志物β-MHC的mRNA水平及蛋白水平均顯著高于NS組（P＜0.05），ERK抑制劑及AA干預(yù)組β-MHC的mRNA及蛋白水平均顯著低于PE組（P＜0.05），見圖5。

討 論

心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)各種刺激因素所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，分為生理性肥厚和病理性肥厚，病理性心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大和心肌間質(zhì)增生，是導(dǎo)致慢性心力衰竭和心源性猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［8］。本課題組前期研究證實(shí)組蛋白乙酰化修飾失衡參與了PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚［9］，而AA能夠抑制組蛋白乙酰化酶（histone acetylases，HATs）介導(dǎo)的組蛋白H3K9高乙酰化進(jìn)而改善心肌肥厚［10］，且進(jìn)一步證實(shí)P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinase，P38 MAPK）信號(hào)通路參與了AA改善PE誘導(dǎo)的心肌肥厚［11］，但MAPK信號(hào)通路家族還包括c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和ERK信號(hào)通路，而ERK和JNK信號(hào)通路是否參與AA改善PE誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚并不清楚。因此，本研究應(yīng)用PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大，來(lái)探討ERK信號(hào)通路在EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K9ac乙?；Ш庵滦募〖?xì)胞肥大中的作用。

Figure 1.The expression of EP300 and H3K9ac in the mouse myocardial cells and their mutual regulation.A：the protein levels of EP300；B：the protein levels of H3K9ac；C：co-immunoprecipitation（Co-IP）in cell lysates of mouse myocardial cells exposed to three different experimental conditionswith anti-EP300-protein Gmagnetic beads and immunoblot（IB）with an anti-H3K9ac or anti-EP300 antibody for evaluation of protein expression.Input：positive control；IgG：negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NSgroup.圖1 小鼠心肌細(xì)胞中EP300和H3K 9ac的表達(dá)水平及其相互調(diào)控關(guān)系

Figure 2.The protein levels of ERK and p-ERK in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞中ERK及p-ERK的蛋白水平

Figure 3.The level of H3K9ac in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.圖3 小鼠心肌細(xì)胞中組蛋白H3K9ac水平的比較

Figure 4.The expression of EP300 in the mouse myocardial cells with different treatments.A：the immunofluorescence images of myocardial cells（scale bar=20μm）；B：the EP300 average optical density；C：the protein levels of EP300 were assayed by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.圖4 小鼠心肌細(xì)胞中組蛋白乙?；窫P300的表達(dá)水平

組蛋白乙?；c基因的活化有著密切關(guān)系，而去乙酰化與基因沉默有關(guān)，組蛋白乙酰化/去乙?；Ш庠谛募》屎裰邪l(fā)揮著重要作用。組蛋白乙?；ㄟ^(guò)HATs介導(dǎo)，HATs在心臟表達(dá)的亞型主要包括：EP300、p300/CBP輔助因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）、組蛋白乙?；赴焙铣赏ㄓ每刂频鞍?（general control nonderepressible-5，GCN5）、CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CBP）和類固醇受體輔活化子1（steroid receptor coactivator-1，SRC1）［12-13］。EP300能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，松解染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而影響基因表達(dá)。EP300/CBP作為一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，能與多種轉(zhuǎn)錄因子互相作用，是介導(dǎo)心肌肥厚的關(guān)鍵因子［14］。EP300和CBP共同調(diào)控心臟肥厚相關(guān)基因過(guò)表達(dá)，可能在PE誘導(dǎo)的心肌肥大中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，在PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大細(xì)胞中，EP300及組蛋白H3K9ac水平顯著高于生理鹽水對(duì)照組，為了進(jìn)一步證實(shí)兩者的關(guān)系，我們進(jìn)一步應(yīng)用免疫共沉淀驗(yàn)證，結(jié)果表明組蛋白H3K9ac受EP300直接調(diào)控。以上結(jié)果提示EP300過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的組蛋白H3K9乙?；揎検Ш饪赡軈⑴c了心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的病理過(guò)程。但是組蛋白乙?；窫P300介導(dǎo)的其他組蛋白（如：H3K27ac）修飾是否參與了病理性心肌肥厚過(guò)程，需進(jìn)一步證實(shí)。

研究顯示在病理性心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞中，ERK磷酸化水平較高，降低其水平可改善心肌肥厚［15］。研究證實(shí)ERK在心肌細(xì)胞中的下游靶點(diǎn)包括EP300和CBP等［16-17］，表明ERK能夠調(diào)控EP300的表達(dá)。當(dāng)ERK受到體內(nèi)、體外刺激時(shí)，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)發(fā)生磷酸化而激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)肥大相關(guān)基因表達(dá)。本研究結(jié)果證實(shí)PE組p-ERK水平顯著升高，與EP300變化水平相一致，但ERK水平并沒有明顯變化，表明ERK并沒有參與PE誘導(dǎo)心肌肥厚的過(guò)程，而ERK可能在上述病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也提示在PE誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠心肌組織中ERK信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，參與心肌肥厚的信號(hào)通路較多，其他信號(hào)通路是否在PE誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚組織中也處于激活狀態(tài)（如JNK）尚待進(jìn)一步研究。研究證實(shí)PE所致的心肌細(xì)胞肥大中MEF-2和β-MHC會(huì)顯著升高［18］，β-MHC是常用的心肌肥厚標(biāo)志物，在心臟收縮功能中起著重要的作用，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了β-MHC的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平。結(jié)果顯示，PE組小鼠心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物β-MHC mRNA水平及蛋白水平均顯著升高，表明β-MHC是判斷PE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的重要標(biāo)志物之一。為進(jìn)一步證實(shí)ERK信號(hào)通路對(duì)EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K9ac乙酰化失衡在PE誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ERK抑制劑U0126及組蛋白乙酰化酶抑制劑AA干預(yù)PE處理的小鼠心肌細(xì)胞，結(jié)果表明分別經(jīng)過(guò)上述兩種抑制劑干預(yù)后的小鼠心肌細(xì)胞中p-ERK、H3K9ac、β-MHC及EP300表達(dá)水平與單純PE處理組相比均顯著降低，進(jìn)一步提示我們ERK信號(hào)通路參與的EP300介導(dǎo)的組蛋白乙酰化失衡參與了PE誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞肥大。

綜上所述，ERK信號(hào)通路在EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K9ac乙?；Ш庵翽E誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞肥大中扮演著重要的角色，提示ERK信號(hào)通路可能成為心肌肥厚防治的新靶點(diǎn)。