內(nèi)皮微粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響及機(jī)制研究*

于博文，王 雪，胡艷紅，楊 靜，李雪麗，修成奎，雷 燕△

（1中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100700；2中國中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動站，北京100700）

血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老可導(dǎo)致血管功能障礙，是多種血管性疾病及衰老相關(guān)性疾病發(fā)生的始動因素［1］。除自由基、端粒、抗衰老基因、線粒體損傷、DNA損傷、蛋白質(zhì)修飾以及熱量限制等學(xué)說之外，內(nèi)皮微粒（endothelial microparticles，EMPs）與衰老以及血管性疾病的關(guān)系引起了學(xué)者們極大的興趣［2-3］。EMPs是從激活或損傷的內(nèi)皮細(xì)胞上脫落的微小囊泡，其直徑約0.1～1μm，含有胞質(zhì)、膜蛋白、RNA和microRNA，具有母體細(xì)胞來源的膜磷脂結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)成分，并攜帶有母體細(xì)胞源的膜表面分子標(biāo)記物［4］。EMPs在生理情況下極少，參與細(xì)胞間信息傳遞，在炎癥反應(yīng)、血管損傷及細(xì)胞遷移等過程中發(fā)揮重要作用。近幾年研究表明，這些經(jīng)常被忽視的EMPs正逐漸成為內(nèi)皮功能障礙的潛在指標(biāo)，是反映內(nèi)皮損傷的新標(biāo)記物，其具有促凝活性，能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［5］，并參與各種病理過程［6-7］。然而，人們對EMPs與血管衰老之間的關(guān)系知之甚少，鮮有報(bào)道衰老對EMPs分泌的影響及EMPs對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。因此，本項(xiàng)工作以復(fù)制性人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）衰老為模型，探討EMPs在HUVECs衰老中的意義及可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自ScienCell。

1.2 試劑內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、青霉素/鏈霉素溶液、胰酶/EDTA消化液0.05%、細(xì)胞凍存液和磷酸鹽緩沖液均購自Scien-Cell；細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal）檢測試劑盒購自Cell Signaling Technology；細(xì)胞衰老C12FDGlacZ基因表達(dá)試劑盒和CountBrightTMAbsolute Counting Bead均購自Molecular Probes；細(xì)胞周期PI/RNase染色緩沖液和Annexin V/FITC均購自BD；PE anti-human CD31 Antibody購自Biolegend；DCFDA細(xì)胞活性氧檢測試劑盒購自Abcam；抑制劑VAS-2870、indomethacin和rotenone均購自Sigma-Aldrich；抑制劑apocynin和sulfaphenazol購自APExBIO。

1.3 儀器倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，AE2000）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，F(xiàn)orma 370）；流式細(xì)胞儀（Beckman，Cytomics FC500、CytoFLEX LX；BD，Accuri C6）；透射電子顯微鏡（Hitachi，H-7650）；超速離心機(jī)（Beckman，Optima L-100 XP）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將HUVECs置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度在90%以上時傳代。棄掉原培養(yǎng)液，DPBS清洗后加入胰酶/EDTA消化液，等細(xì)胞皺縮變圓時終止消化，收集細(xì)胞并離心。棄上清后重懸，按照1∶2傳代培養(yǎng)。

2.2 復(fù)制性衰老模型的建立及分組通過傳代的方法將HUVECs培養(yǎng)至10～12代，建立復(fù)制性衰老模型。年輕內(nèi)皮細(xì)胞（young endothelial cells，young ECs）采用第2～4代HUVECs；衰老內(nèi)皮細(xì)胞（aged endothelial cells，aged ECs）采用第10～12代HUVECs。實(shí)驗(yàn)分為young ECs組、aged ECs組及EMPs干預(yù)組（EMPs+young ECs組）。

2.3 SA-β-gal細(xì)胞化學(xué)法染色及熒光法染色SAβ-gal活性的檢測方法包括細(xì)胞化學(xué)法和熒光法：細(xì)胞化學(xué)法簡單、快速，但需在顯微鏡下選擇視野，人工計(jì)算細(xì)胞數(shù)量；熒光法分析更為靈敏，是在群體和單個細(xì)胞水平上定量SA-β-gal陽性細(xì)胞的最佳方法，該方法將活細(xì)胞與C12FDG（一種β-gal底物）同時孵育，而C12FDG被β-gal裂解后會產(chǎn)生熒光，因此可用流式細(xì)胞儀檢測和定量。

細(xì)胞化學(xué)法：將第2代及第10代細(xì)胞以5×107/L接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用DPBS洗滌1次，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 mL，室溫固定15 min后，吸除細(xì)胞固定液，用DPBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入β-gal染色工作液1 mL，置于無CO2的37°C培養(yǎng)箱中孵育過夜后，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

熒光法：將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)至所需融合度，吸除原培養(yǎng)液，加入含300μmol/L氯喹的培養(yǎng)基孵育1 h，吸除后加入含33μmol/L C12FDG的培養(yǎng)液孵育1 h，吸除后用冷DPBS洗滌1次，消化細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀（BDAccuri C6）檢測熒光強(qiáng)度。

2.4 PI單染法檢測細(xì)胞周期消化并收集細(xì)胞，500×g離心5 min，棄上清。將細(xì)胞懸液加入70%冷乙醇中，固定過夜。500×g離心5 min，棄上清。加入400μL PI/RNase染色液，充分混勻細(xì)胞后，37°C孵育15 min后上流式細(xì)胞儀（Beckman Cytomics FC500）檢測。

2.5 兩步離心法分離出內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒在無菌條件下，通過兩步離心法從衰老細(xì)胞的培養(yǎng)基中收集EMPs。在室溫下800×g離心15 min，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片；然后在13 000×g、4°C下離心60 min，棄上清，用緩沖液或培養(yǎng)液重懸微粒用于檢測或干預(yù)培養(yǎng)。

2.6 透射電鏡觀察內(nèi)皮微粒采用醋酸雙氧鈾負(fù)染法，在染色前將染液從4℃拿出，恢復(fù)室溫后再進(jìn)行如下操作：（1）取EMPs懸浮液20μL，滴于碳膜銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余樣品；（2）將染色液滴在銅網(wǎng)上，留置1 min，然后用濾紙吸去殘留液；（3）室溫干燥銅網(wǎng)，透射電鏡下觀察并拍照。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮微粒首先，對EMPs進(jìn)行標(biāo)記。取已制備好的內(nèi)皮微粒懸浮液樣本50μL，加入5μL PE anti-human CD31 Antibody或FITCAnnexin V孵育15 min（加入CD31抗體的樣本需在冰上孵育，加入Annexin V的樣本需常溫孵育），再加入400μL staining buffer或Annexin V binding buffer稀釋待測。然后，用已知直徑的標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)α魇郊?xì)胞儀（Beckman CytoFLEX LX）進(jìn)行尺寸校準(zhǔn)，圈定0.1 μm～1μm范圍的門；最后，在上機(jī)檢測前向樣本中加入已知濃度的標(biāo)定珠（Counting Beads），圈定相應(yīng)的標(biāo)定珠門，從而計(jì)數(shù)定量。計(jì)數(shù)算法為：concentration of sample as EMPs/μL=A/B×C/D，A=number of EMPevents，B=number of bead events，C=assigned bead count of the lot（beads/50μL），D=volume of sample（μL）。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，對應(yīng)地算出每組EMPs總量。在收取樣本的同時對每組進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)，因此數(shù)據(jù)最終的呈現(xiàn)形式為每103個細(xì)胞產(chǎn)生的EMPs數(shù)量。

2.8 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測消化并收集細(xì)胞，用含10μmol/L DCFDA的無酚紅培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行染色，并在37°C下孵育30 min。染色完成后，用EMPs懸浮液處理細(xì)胞，4 h后上流式細(xì)胞儀分析。由488 nm波長激光激發(fā)，在535 nm（FL1通道）波長處檢測。不需要干預(yù)處理的組在染色完成后直接上機(jī)檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，3組或更多組的組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1 建立并驗(yàn)證復(fù)制性衰老模型

對young ECs和aged ECs分別進(jìn)行SA-β-gal細(xì)胞化學(xué)法染色和C12FDG熒光法染色?？捎^察到，與圖1A中young ECs相比，圖1B中aged ECs細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞間間隙增寬，SA-β-gal藍(lán)染比例明顯增多。圖1B中藍(lán)色輪廓區(qū)域?yàn)閥oung ECs的流式熒光直方圖，黑色輪廓為aged ECs的流式熒光直方圖，可觀察到aged ECs的熒光輪廓明顯右移。對3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的中位熒光強(qiáng)度值（median fluorescence intensity，MFI）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示與young ECs相比，aged ECs MFI值顯著提高（P＜0.01），即aged ECs的SA-β-gal活性顯著增強(qiáng)。以上兩種方法的結(jié)果趨勢一致，但由于熒光法更為靈敏，因此本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用熒光法來評價(jià)SA-β-gal活性。

用PI單染法對young ECs和aged ECs分別進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，結(jié)果表明：與young ECs相比，aged ECs的G0/G1期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞所占百分比顯著降低（P＜0.01），S期細(xì)胞所占百分比顯著增高（P＜0.01），見圖2。

2 透射電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒的形態(tài)及大小

內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒直徑在0.1～1μm之間，形態(tài)呈圓形或橢圓形，其囊泡膜結(jié)構(gòu)完整，邊緣清楚，輪廓清晰，見圖3。

3 衰老對內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒的影響

圖4A中黑色箭頭所指為對EMPs和標(biāo)定珠（Counting Beads）所圈定的門。從圖4B和圖4C的流式散點(diǎn)圖中可觀察到，與young ECs相比，aged ECs所分泌的CD31+EMPs及Annexin V+EMPs均增多。圖4D中統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與young ECs相比，aged ECs所分泌的CD31+EMPs及Annexin V+EMPs均顯著增多（P＜0.05）。相同條件下內(nèi)皮細(xì)胞分泌的Annexin V+EMPs顯著少于CD31+EMPs（P＜0.05），兩種標(biāo)記方式得到的數(shù)據(jù)變化整體趨勢一致，具備可信度。

Figure 1.Difference of SA-β-gal activity between young and aged endothelial cells（ECs）.A：SA-β-gal staining of young ECs and aged ECs（scale bar=50μm）；B：flow cytometry of SA-β-gal fluorescence staining.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.圖1 年輕組與衰老組SA-β-gal活性差異

Figure 2.Difference of cell cycle between young and aged endothelial cells（ECs）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.圖2 年輕組與衰老組細(xì)胞周期的差異

Figure 3.Morphological changes and size of EMPsunder transmission electron microscope.The scale bar=100 nm.圖3 透射電鏡下EMPs的形態(tài)和大小

Figure 4.Difference in the amount of EMPs secreted by young and aged endothelial cells（ECs）.A：the gates of EMPs and counting beads；B：scatter plot of CD31+EMPs；C：scatter plot of Annexin V+EMPs；D：difference of EMPs secreted by young and aged ECs.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs young ECs；#P＜0.05 vs CD31+EMPs.圖4 年輕組與衰老組分泌EMPs數(shù)量的差異

4 內(nèi)皮微粒對內(nèi)皮細(xì)胞早衰的影響

用流式細(xì)胞術(shù)C12FDG熒光法檢測EMPs干預(yù)young ECs后，SA-β-gal活性的變化情況。圖5A中藍(lán)色輪廓區(qū)域?yàn)閥oung ECs的流式熒光直方圖，紅色輪廓為EMPs干預(yù)young ECs 48 h后的流式熒光直方圖?？煽闯鯡MPs干預(yù)young ECs后，熒光輪廓明顯右移。圖5B統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，EMPs干預(yù)young ECs后，MFI值顯著提高（P＜0.01），即SA-β-gal活性顯著增強(qiáng)。

與young ECs相比，EMPs干預(yù)young ECs 48 h后G0/G1期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞所占百分比顯著降低（P＜0.01），S期細(xì)胞所占百分比顯著增高（P＜0.01），見圖6。

5 內(nèi)皮細(xì)胞膜微粒對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

Figure 5.Change of SA-β-gal activity of young endothelial cells（ECs）treated with EMPs for 48 h.A：C12FDGfluorescence staining histogram of young ECs treated with aged EMPs；B：change of SA-β-gal median fluorescence intensity（MFI）of young ECs treated with aged EMPs.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.圖5 EMPs干預(yù)young ECs 48 h后SA-β-gal活性的變化

圖7A中藍(lán)色輪廓區(qū)域?yàn)閥oung ECs內(nèi)ROS的流式熒光直方圖，黑色輪廓為aged ECs內(nèi)ROS的流式熒光直方圖，可觀察到aged ECs內(nèi)ROS的熒光輪廓明顯右移。圖7B中統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與young ECs相比，aged ECs內(nèi)ROS的MFI值顯著增高（P＜0.01），即衰老內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于年輕內(nèi)皮細(xì)胞。

圖8A中藍(lán)色輪廓區(qū)域?yàn)閥oung ECs內(nèi)ROS的流式熒光直方圖，紅色輪廓為EMPs干預(yù)young ECs 4 h后的ROS直方圖，灰色輪廓為干預(yù)的同時加入氧化應(yīng)激抑制劑后（以apocynin為例）的ROS直方圖，從圖中可觀察到EMPs干預(yù)young ECs后，ROS的熒光輪廓明顯右移，而在干預(yù)的同時加入抑制劑可使ROS的熒光輪廓右移減少。圖8B中統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與young ECs相比，EMPs干預(yù)young ECs后，細(xì)胞內(nèi)ROS的MFI值顯著增高（P＜0.01），而在同時加入抑制劑Apocynin或Rotenone后，EMPs所誘導(dǎo)增高的ROS被顯著抑制（P＜0.05）；抑制劑VAS-2870、indomethacin和sulfaphenazol則未能起到該作用。

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老是血管老化的重要病理改變，并且在內(nèi)皮功能障礙及相關(guān)性血管疾病中發(fā)揮重要作用［8］。Raitoharju等［9］提出內(nèi)皮微?？赏ㄟ^多種分子途徑影響血管衰老，從而調(diào)控動脈粥樣硬化的早期和晚期階段。Diehl等［10］證實(shí)微粒是miRNAs的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體，由其母細(xì)胞進(jìn)行特異性包裝，并通過血液中循環(huán)的微粒將基因調(diào)節(jié)功能從微粒釋放細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞上。而miRNA被報(bào)道可參與內(nèi)皮細(xì)胞衰老的調(diào)控機(jī)制，影響內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的血管反應(yīng)性和血管重建［9，11］。此外，研究表明微粒脫落增多與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)，而內(nèi)皮功能障礙是衰老及血管性疾病的主要表現(xiàn)［12-13］。因此，EMPs與內(nèi)皮細(xì)胞衰老之間的關(guān)系值得深入研究，目前關(guān)于衰老對EMPs分泌的影響及EMPs對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用的研究報(bào)道較少。

在本研究中，我們觀察到EMPs為圓形或橢圓形、邊緣清楚、輪廓清晰的囊泡。并進(jìn)一步對不同狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞分泌EMPs的數(shù)量進(jìn)行分析。流式細(xì)胞術(shù)是目前分析EMPs的金標(biāo)準(zhǔn)，其具體方法為：首先用已知直徑的標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行尺寸校準(zhǔn)，圈定0.1～1μm范圍的門；其次對EMPs進(jìn)行標(biāo)記，同時定量。標(biāo)記EMPs常用的方法有兩種：其一，由于內(nèi)皮細(xì)胞以出芽的方式分泌EMPs，其囊泡膜表面同樣也含有細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）分子。Annexin V是Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，與PS有超強(qiáng)的親和力，因此可用Annexin V標(biāo)記PS+EMPs；其二，由于微粒攜帶有母體細(xì)胞源的膜表面分子標(biāo)記物，因此可用相對應(yīng)的抗體來標(biāo)記微粒。EMPs自身帶有特異性抗原CD31分子，因此可用CD31抗體來標(biāo)記CD31+EMPs。定量EMPs也有兩種方法：一是在分析前的樣品中加入已知濃度和體積的微球，間接計(jì)算樣品微粒濃度；二是預(yù)先確定流式細(xì)胞儀的流速，則可計(jì)算每個分析體積的樣品微粒數(shù)［14］。有研究報(bào)道EMPs在脫落時其囊泡表面可能未攜帶PS分子，致使少部分EMPs未能與Annexin V結(jié)合［15］。為避免分析結(jié)果不準(zhǔn)確，本研究采用CD31抗體和Annexin V兩種標(biāo)記方式，證明了衰老內(nèi)皮細(xì)胞分泌的EMPs顯著增多。

Figure 6.Change of cell cycle of young endothelial cells（ECs）treated with EMPs for 48 h.A：cell cycle histogram of young ECs treated with EMPs；B：change of cell cycle distribution of young ECs treated with EMPs.Mean±SD.n=3.*P＜0.01 vs young ECs.圖6 EMPs干預(yù)young ECs 48 h后細(xì)胞周期的變化

既往研究表明，在糖尿病大鼠中，內(nèi)皮微粒隨著年齡增長而增加［16］；在血栓性老年小鼠中，白細(xì)胞來源的微粒也增加［17］。在正常人中，表達(dá)p選擇素的血小板微粒隨著年齡增長而增加［18］。相反，F(xiàn)orest等［19］報(bào)道75歲及以上的人內(nèi)皮微粒減少。以上研究對衰老過程中微粒水平的報(bào)道相互矛盾，并且都涉及到體內(nèi)血漿微粒水平的測量，而其中微粒清除率可能是血漿微粒水平的重要決定因素。因此，為了避免微粒清除機(jī)制等可能的混雜因素，本研究使用內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制性衰老模型［20-21］，在體外檢測內(nèi)皮微粒的分泌數(shù)量。

衰老會引起細(xì)胞體積增大、細(xì)胞周期改變以及pH依賴性β-半乳糖苷酶表達(dá)等［22-23］。目前，SA-β-gal活性是研究細(xì)胞衰老的常用生物標(biāo)志物。因此，本研究聯(lián)合采用了SA-β-gal染色法及細(xì)胞周期檢測兩種方式對衰老進(jìn)行表征，首先驗(yàn)證了復(fù)制性衰老模型的建立，即與年輕內(nèi)皮細(xì)胞相比，衰老內(nèi)皮細(xì)胞的SA-β-gal活性增強(qiáng)，且細(xì)胞周期阻滯于S期。進(jìn)一步，通過EMPs干預(yù)年輕內(nèi)皮細(xì)胞后SA-β-gal活性增高及細(xì)胞周期阻滯于S期，證明了衰老內(nèi)皮細(xì)胞分泌的EMPs可導(dǎo)致年輕內(nèi)皮細(xì)胞早衰。

內(nèi)皮活性氧主要來源于線粒體、內(nèi)皮一氧化氮合成酶（eNOS）和NADPH氧化酶4（Nox4）［24］。過量ROS是氧化應(yīng)激的主要原因，也是內(nèi)皮衰老及相關(guān)疾病的主要原因之一。既往研究表明，氧化應(yīng)激是內(nèi)皮細(xì)胞衰老的主要誘因，可介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞早衰及復(fù)制性內(nèi)皮細(xì)胞衰老［25］。雖然ROS與內(nèi)皮細(xì)胞衰老密切相關(guān)，然而內(nèi)皮微粒是否通過ROS介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老尚不完全清楚。本研究明確了衰老內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的EMPs可誘導(dǎo)年輕內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，這可能是EMPs介導(dǎo)年輕內(nèi)皮細(xì)胞早衰的原因。并且該過程可部分被抑制劑Apocynin或Rotenone阻礙，說明了EMP誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS部分來源于NADPH氧化酶和線粒體的激活。

Figure 7.Difference of reactive oxygen species between young and aged endothelial cells（ECs）.A：flow cytometric histogram of ROSin young and aged ECs；B：difference of ROSfluorescence intensity between young and aged ECs.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs young ECs.圖7 年輕組與衰老組細(xì)胞內(nèi)ROS的差異

Figure 8.Changes of ROSlevel in young endothelial cells（ECs）after treatment with EMPs.A：flow cytometric histogram of ROSin young ECs treated with EMPs and apocynin；B：changes of ROSfluorescence intensity in young ECs treated with EMPs and inhibitors.Apocynin：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase inhibitor；VAS-2870：NADPH oxidase inhibitor；indomethacin：cyclooxygenases inhibitor；Sulfaphenazol：cytochrome P450 inhibitor；rotenone：mitochondrial oxidase inhibitor.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs young ECs group；$P＜0.05 vs EMPs group.圖8 EMPs干預(yù)young ECs后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化

綜上所述，本研究表明衰老內(nèi)皮細(xì)胞分泌的EMPs多于年輕內(nèi)皮細(xì)胞，衰老內(nèi)皮細(xì)胞分泌的EMPs可導(dǎo)致年輕內(nèi)皮細(xì)胞早衰及細(xì)胞周期阻滯。此外，衰老內(nèi)皮細(xì)胞分泌的EMPs可通過NADPH氧化酶和線粒體的激活，誘導(dǎo)年輕內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高。因此，EMPs可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高，從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞早衰，但其具體機(jī)制尚需深入研究。