博來霉素誘導肺纖維化小鼠中差異表達的lncRNA篩選及生物信息學分析*

黃明華，程玲芳，胡婷婷，蘇 建，葉玲玲，曾林祥

（南昌大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江西南昌330000）

肺纖維化是一種慢性進行性致死性疾病，是多種肺疾病的終末期改變，特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是其中一種常見的臨床類型［1］。目前認為肺纖維化是肺泡正常細胞受理化因素損傷后，上皮細胞或內(nèi)皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成（?。┏衫w維細胞，肌成纖維細胞分泌纖連蛋白或膠原蛋白等細胞外基質(zhì)對肺間質(zhì)進行修補形成的，以肌成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)大量沉積為特征［2-4］，但其發(fā)病機制尚未明確，目前缺乏有效的治療策略。目前多國批準吡非尼酮與尼達尼布用于IPF患者的抗纖維化治療。在博來霉素（bleomycin，BLM）誘導的肺纖維化小鼠模型中，吡非尼酮在預防給藥模型中效果更優(yōu)，而尼達尼布在早期、晚期和全程治療模型中效果更優(yōu)［5］。但是，臨床研究提示，二者雖可改善患者的肺功能，并不能顯著提高生存率［6-7］。

近年來高通量基因測序及轉(zhuǎn)錄組分析技術快速發(fā)展，研究顯示人類基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)中，高達98%是無蛋白質(zhì)編碼功能的，稱為非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），僅約基因組總數(shù)2%的基因能夠編碼蛋白質(zhì)。研究顯示非編碼RNA參與調(diào)控多種生物 學 過 程［8-11］。長 鏈 非 編 碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt，缺乏明顯開放閱讀框的RNA分子。lncRNA的轉(zhuǎn)錄具有時間特異性與組織特異性，其轉(zhuǎn)錄本作為信號分子，進一步調(diào)控其他基因的表達；lncRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA（competitng endogenous RNA，ceRNA）吸附某些特定的微小RNA（microRNA，miRNA），從而調(diào)控相關miRNA靶基因的表達［9，12］。

本研究擬建立BLM誘導的肺纖維化小鼠模型，利用基因芯片技術對小鼠肺組織的基因表達譜進行分析，篩選小鼠肺纖維化組織中差異表達明顯的lncRNA。再綜合利用生物信息學工具對其進行靶基因預測，并行GO富集和KEGG信號通路分析，識別出肺纖維化小鼠中差異表達的lncRNA及其靶基因，并分析其可能調(diào)控的信號通路。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級6～8周齡C57BL/6雄性小鼠12只，體重約20～22g，購買自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號為SCXK（湘）2019-0004。

2 主要實驗試劑

BLM購于海正輝瑞制藥有限公司；HE染色試劑盒和戊巴比妥鈉購于上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑購于Thermo；RNA純化試劑盒購于QIAGEN；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

3 主要實驗儀器

烤片機（德國美康）；熱循環(huán)儀（萊普特科學儀器有限公司）；安捷倫芯片掃描儀、分子雜交盒、分子雜交箱和雜交箱旋轉(zhuǎn)器（Agilent）。

4 方法

4.1 實驗分組與肺纖維化模型建立將實驗小鼠隨機分為兩組：實驗（BLM）組和對照（normal control，NC）組（n=6）。肺纖維化小鼠模型的構建依據(jù)課題組先前經(jīng)驗［13］，確定經(jīng)氣管內(nèi)滴注BLM的劑量為3 mg/kg。充分麻醉后，向?qū)嶒灲M小鼠氣管內(nèi)一次性滴入BLM（3 mg/kg）構建肺纖維化模型，向?qū)φ战M小鼠氣管內(nèi)滴入等量的生理鹽水，記為第0天，常規(guī)自由飲食。于第21天腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，并分別收集兩組小鼠各葉肺組織。取部分肺組織于4%多聚甲醛固定24 h后，制作石蠟切片，用于HE染色和Masson染色；剩余肺組織經(jīng)液氮速凍后，保存于-80℃冰箱。

4.2 HE染色和Masson染色

4.2.1 HE染色（1）石蠟切片脫蠟至水，依次將切片放入二甲苯Ⅰ中20 min→二甲苯Ⅱ中20 min→無水乙醇Ⅰ中5min→無水乙醇Ⅱ中5 min-75%乙醇中5 min，自來水沖洗；（2）蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，流水沖洗；（3）切片依次入85%和95%的梯度乙醇脫水，入伊紅染液中染色5 min；（4）切片依次放入無水乙醇I中5 min→無水乙醇Ⅱ中5 min→無水乙醇Ⅲ中5 min→二甲苯Ⅰ中5 min→二甲苯Ⅱ中5 min透明，中性樹膠封片。

4.2.2 Masson染色（1）石蠟切片脫蠟至水，依次將切片放入二甲苯Ⅰ中20 min-二甲苯Ⅱ中20 min-無水乙醇Ⅰ中5 min-無水乙醇Ⅱ中5 min-75%乙醇中5 min，自來水沖洗；（2）切片放入重鉻酸鉀浸泡過夜，自來水沖洗；（3）鐵蘇木素A液與B液等比混合成鐵蘇木素染液，切片入鐵蘇木素3 min，自來水沖洗，鹽酸酒精溶液分化，自來水沖洗；（4）切片放入麗春紅酸性品紅浸染5～10 min，自來水漂洗；（5）磷鉬酸水溶液浸染1～3 min；磷鉬酸之后不用水洗，直接入苯胺藍染液染3～6 min；（6）切片用1%冰醋酸分化，兩缸無水乙醇脫水；（7）切片放入第3缸無水乙醇中浸泡5 min，二甲苯中浸泡5 min透明，中性樹膠封片。

4.3 RNA抽提與質(zhì)檢使用Trizol試劑提取肺組織標本總RNA并按照試劑盒進行純化。經(jīng)分光光度計NanoDrop 2000及Agilent Bioanalyzer 2100對其進行質(zhì)檢。

4.4 微陣列雜交采用Agilent 4×180 K表達譜芯片挑選質(zhì)檢合格的BLM組（n=2）及對照組（n=2）標本RNA共2對進行雜交和掃描。

4.5 生物信息學分析采用R軟件的數(shù)據(jù)集limma對初始數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，利用差異倍數(shù)（fold change＞2.0）來篩選肺纖維化相關的差異表達基因。對差異表達的lncRNA進行靶基因順式作用（cis-）和反式作用（trans-）預測，并對靶基因進行GO富集和KEGG信號通路分析。

結 果

1 肺纖維化小鼠模型的建立

HE染色觀察肺組織的纖維化程度，結果顯示，對照組中肺泡結構完整無破壞，肺泡壁無增厚，肺泡腔內(nèi)未見炎癥細胞浸潤，見圖1A；BLM組中肺組織正常的肺泡結構被破壞，肺泡間隔顯著增厚，成纖維細胞增生，肺泡腔縮小，可見炎癥細胞浸潤，見圖1B。Masson染色檢測肺組織膠原沉積情況，相對于正常組，BLM組可見諸多藍染的膠原，表明經(jīng)BLM處理后小鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)大量膠原蛋白沉積，見圖1C、1D。說明BLM誘導肺纖維化建模成功。

2 在BLM誘導的肺纖維化小鼠中差異表達的lncRNA篩選

通過芯片微陣列分析，識別在對照組與BLM組小鼠肺組織中差異表達的lncRNA，見圖2。以差異倍數(shù)＞2.0為篩選條件，共得到1 384個有差異表達的lncRNA，其中表達上調(diào)的lncRNA有645個，表達下調(diào)的lncRNA有739個；其中表達上調(diào)10倍以上的lncRNA有8個，表達下調(diào)5倍以上的lncRNA有15個，表1展示了部分差異表達顯著的lncRNA。

3 差異表達顯著的lncRNA順式（cis-）作用和反式（trans-）作用的靶基因預測

通過對差異表達明顯的lncRNA進行靶基因預測，結果表明17個lncRNAs具有靶基因，其中5個通過順式（cis-）作用對靶基因進行調(diào)控，靶基因分別是Chl1、Col24a1、Cdc25、Fam53c、Il-7和Nrep；2個是通過反式（trans-）作用來對靶基因進行調(diào)控，靶基因分別是Kdm5c和Rhbdd2；另10個可同時通過順式和反式兩種作用方式來對靶基因進行調(diào)控，靶基因分別為Chl1、Tnfrsf10b、Gjc3、Maoa、Vmn1r58、Syt12、Lix1、Gpr157和Mbd4等，見表2。

Figure 1.A mouse model of bleomycin（BLM）-induced pulmonary fibrosis was established.A and B：HE staining showed clear alveolar space structure in the normal control group，no thickening of alveolar walls，and no obvious inflammatory cell infiltration.Compared with the normal control group，the lung tissue alveolar structure of BLM-induced pulmonary fibrosis mice was destroyed，the alveolar cavity was narrowed，the tissue interval was thickened，and the fibroblast foci were formed，accompanied by inflammatory cell infiltration.C and D：Masson staining showed that the lung tissue of the normal control group had clear alveolar structure，normal tissue spacing，and no obvious collagen deposition.In BLM group，the alveolar structures were damaged，tissue spacers were thickened，and a large number of blue stained collagen depositions were significantly increased.圖1 肺纖維化小鼠模型的建立

4 GO富集與KEGG信號通路分析

通過對差異表達顯著的lncRNA的靶基因從細胞成分，生物過程和分子功能3個方面進行GO富集，見圖3A，結果顯示cis靶基因GO富集中主要有Ⅰ型干擾素結合受體，STAT蛋白絲氨酸磷酸化和肌漿網(wǎng)鈣離子轉(zhuǎn)運等；trans靶基因富集條目中，主要有細胞組分端粒酶全酶復合體，RNA監(jiān)控機制和壞死性凋亡小體等。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因可能參與的信號通路進行分析，共得到78條信號轉(zhuǎn)導通路，主要包括鈣信號通路、PI3K-AKT信號通路、Ras信號通路、Wnt信號通路、mTOR信號通路、JAKSTAT信號通路、TGF-β信號通路、P53信號通路、Notch信號通路、Toll樣受體信號通路和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等，見圖3B。

Figure 2.Analysis of differentially expressed lncRNAs in chip results.A：scatter plot analysis of lncRNA data in BLM group and NC group identified in chip；B：cluster analysis heat map showed differentially expressed lncRNAs in mouse model of pulmonary fibrosis.圖2 基因芯片結果中差異表達lncRNA的分析

表1 肺纖維化小鼠肺組織中部分顯著差異表達的lncRNATable 1.Part of differentially expressed lncRNAs in lung tissue of pulmonary fibrosis mice

表2 差異表達lncRNA的靶基因預測Table 2.Target gene prediction of differentially expressed lncRNAs

Figure 3.GO enrichment and KEGG signaling pathway analysis of target genes predicted by differentially expressed lncRNAs.A：GO enrichment analysis on target genes predicted by differentially expressed lncRNAs from three aspects of cell components，biological processes and molecular functions；B：KEGGsignaling pathway analysis of target genes predicted by differentially expressed lncRNAs.圖3 GO富集和KEGG信號通路分析

討 論

BLM是一種抗腫瘤藥物，因其可致肺纖維化的不良反應而被應用于肺纖維化及IPF相關動物模型的建立。BLM是目前研究慢性進展性肺疾病最廣泛使用的模型藥物之一，包括批準用于減緩某些IPF亞群進展的吡非尼酮和尼達尼布的臨床前開發(fā)均使用了BLM誘導的肺纖維化模型。雖然BLM誘導小鼠肺纖維化模型不能完全模擬臨床IPF患者的病理進程［14］，但BLM動物模型仍然是研究肺纖維化疾病發(fā)病機理和測試新型藥物或化合物的常用的實驗工具之一。

近年來，非編碼RNA在肺纖維化的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。隨著miRNA在疾病中的廣泛研究，lncRNA在疾病中的作用也引起了研究者的廣泛關注。多項研究提示lncRNA在心肌纖維化、肝纖維化和腎纖維化等多種纖維化疾病中發(fā)揮作用［15-18］，而lncRNA在肺纖維化中的研究目前尚少。

在本研究中，我們通過基因芯片技術分析BLM誘導的小鼠肺纖維化模型中l(wèi)ncRNAs的表達，篩選出差異表達的lncRNAs共1 384個，其中表達上調(diào)2倍及以上的lncRNAs有645個，表達下調(diào)2倍及以上的lncRNAs有739個；表達上調(diào)10倍以上的lncRNAs有8個，表達下調(diào)5倍以上的lncRNAs有15個。有研究［19］通過微陣列分析了二氧化硅誘導的肺纖維化大鼠肺組織中有682個差異表達的lncRNAs，其中300個表達上調(diào)，382個表達下調(diào)。由于使用不同的誘導試劑及實驗對象，結果具有一定的差異。IPF這個疾病本身具有明顯的異質(zhì)性，其致病機制可能涉及多基因多途徑共同作用，且在不同個體可能起主導作用的基因或途徑不盡相同。LncRNA可通過與染色質(zhì)結合連接DNA和蛋白質(zhì)，并作為修飾蛋白質(zhì)復合物的支架，通過調(diào)控染色質(zhì)的循環(huán)，將啟動子與增強子或增強子樣的非編碼基因連接起來，并通過將它們導向特定的位點，賦予組蛋白修飾復合物特異性［20］。目前較多的研究主要是lncRNA作為ceRNA吸附某些特定的miRNA，從而調(diào)控相關miRNA靶基因的表達。lncRNA NONMMUT065582被指定為肺纖維化相關RNA（plumonary fibrosis-accociated RNA，PFAR），在患有肺纖維化的小鼠的肺組織及纖維化肺成纖維細胞中被上調(diào)，lncRNA PFAR通過靶向miR-138來調(diào)節(jié)YAP1-Twist軸從而促進肺成纖維細胞活化和纖維化［21］。研究顯示lncRNA ZEB1-AS1在BLM誘導的大鼠和TGF-β1誘導的RLE-6TN細胞中上調(diào)，通過競爭性結合miR-141-3p，lncRNA ZEB1-AS1通過zeb1介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進肺纖維化［22］。目前鑒定出的lncRNAs除少數(shù)外，大部分沒有正式的命名和確定的功能研究，值得進一步探究。在我們的芯片結果中，lncRNA Gm16685在小鼠肺纖維化組織中表達下調(diào)，靶基因預測顯示白細胞介素7（interleukin-7，IL-7）是差異基因Gm16685的靶基因，Gm16685通過cis-調(diào)控來調(diào)節(jié)IL-7的表達水平。IL-7最初由骨髓基質(zhì)細胞分離出來，諸多研究表明它能抑制腫瘤、骨髓纖維化和肺纖維化等的發(fā)生發(fā)展。有研究提示IL-7能抑制肺纖維化中成纖維細胞TGF-β的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導［23］。此外，有研究觀察到IL-7在使用多粘菌素B治療IPF急性加重后，表達顯著增加［24］，表明IL-7在肺纖維化中可能起重要作用，而在肺纖維化小鼠中l(wèi)ncRNA Gm16685對IL-7的具體的作用機制，還有待進一步的研究。此外，本研究對差異表達的lncRNAs進行靶基因預測，并進行GO功能注釋分析，結果顯示這些肺纖維化小鼠肺組織中差異表達的lncRNAs可通過順式（cis-）和/或反式（trans-）調(diào)控來調(diào)節(jié)其靶蛋白編碼基因的表達，從而參與調(diào)控分子功能及生物過程等。lncRNA可通過多種方式發(fā)揮生物學作用。對差異表達的lncRNAs進行KEGG信號通路分析，提示lncRNAs的靶基因可參與肺纖維化中多條信號通路。近年來，各種信號通路在肺纖維化中的作用逐漸成為國內(nèi)外學者關注的重點［25-27］。有研究報道m(xù)TOR通路激活參與肺纖維化過程，上調(diào)的lncRNA AP003419.16通過調(diào)控RPS6KB2，從而激活了mTOR信號通路促進了IPF的發(fā)生［28］。信號通路在肺纖維化疾病中作用機制多樣復雜，且多個通路及其中的轉(zhuǎn)導分子相互交叉成調(diào)控網(wǎng)絡，共同調(diào)控肺纖維化相關基因的表達。

綜上所述，我們通過芯片微陣列技術分析BLM誘導小鼠肺纖維化模型與正常小鼠肺組織中差異表達的lncRNA，并且通過生物信息學分析差異lncRNA的靶基因及對靶基因進行GO富集與KEGG信號通路分析，識別出與小鼠肺纖維化密切相關的lncRNA，為肺纖維化研究提供了參考資料。