紫云英苷誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞系OCI-LY8凋亡*

王 瑜，朱明了，何施燕，陳 弘，陳佳玉

（紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興312000）

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見的侵襲性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），約占NHL的41%［1］。美羅華+環(huán)磷酰胺+阿霉素+長春新堿+潑尼松聯(lián)合用藥是目前DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，可使患者5年生存率＞71%［2］，但因有明顯毒副作用，且＞1/3的患者治療后會復(fù)發(fā)［3］，不能實現(xiàn)對DLBCL的完全治療。對于復(fù)發(fā)或難治性DLBCL患者，常需干細(xì)胞移植，但該法費用貴，供體難尋，排斥率高，有較大風(fēng)險，且往往只能緩解癥狀，不能徹底治愈［4］。因此，尋找高效治療DLBCL的替代藥物一直是該領(lǐng)域研究的熱點。

紫云英苷（astragalin）屬于黃酮類化合物，普遍存在于藥用植物中，有抗炎、抗氧化和保護心肌的功能［5-6］。有研究表明，astragalin可通過活化caspase-3而發(fā)揮抗黑色素瘤作用［7］，但其抗DLBCL作用尚未見報道。因此，本研究擬觀察astragalin對DLBCL細(xì)胞系OCI-LY8的作用及其分子機制。

材料和方法

1 實驗材料

OCI-LY8細(xì)胞為本實驗室所保存。清潔級BALB/c小鼠購自于浙江省實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（滬）2013-0016。Astragalin購自深圳市美荷生物科技有限公司；CCK-8為日本同仁公司產(chǎn)品；Hoechst 33342、BCA蛋白濃度測定試劑盒以及RIPA裂解液（強）均購自上海碧云天公司；AnnexinVFITC/PI雙染試劑盒及脫脂奶粉購自BD；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640培養(yǎng)液以及胰蛋白酶均購自Gibco；Ⅰ抗和酶標(biāo)Ⅱ抗購自武漢博士德生物技術(shù)公司；RT-qPCR引物源自上海生工生物公司；Trizol和SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis System購自Invitrogen；ECL化學(xué)發(fā)光液購自Sigma。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，將處于對數(shù)生長期的OCI-LY8細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至8×107/L，分別接種于96孔板（每孔100μL）和6孔板（每孔2 mL）中，均置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測OCI-LY8細(xì)胞活力取上述96孔培養(yǎng)板，加入astragalin，使其終濃度分別為0、1、5、25和125μg/L，孵育0、24、48和72 h，設(shè)3復(fù)孔，加入CCK-8溶液每孔10μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3 h，于490 nm波長下經(jīng)酶標(biāo)儀檢測吸光度（A）值，分析OCI-LY8細(xì)胞活力，并作生長曲線。

2.3 Hoechst 33342染色觀察OCI-LY8細(xì)胞核的變化取上述6孔培養(yǎng)板，加入astragalin，使其終濃度分別為0、5、25和125μg/L，設(shè)3復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下孵育24 h后離心，棄上清，PBS洗3次，用10 μg/L Hoechst 33342染色，室溫條件下避光染色10 min，PBS洗3次，加入50μL PBS，熒光倒置顯微鏡下觀察OCI-LY8細(xì)胞核變化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析OCI-LY8細(xì)胞凋亡率取上述6孔培養(yǎng)板，加入astragalin，使其終濃度分別為0、5、25和125μg/L，設(shè)3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后離心，棄上清，PBS洗2次，用細(xì)胞凋亡死亡雙染試劑盒染色15 min，PBS洗2次，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和死亡率（試劑用量和染色方法按試劑說明書進行）。

2.5 RT-qPCR檢測OCI-LY8細(xì)胞內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平用含有0μg/mL和25μg/m Lastragalin的培養(yǎng)液孵育OCI-LY8細(xì)胞24 h，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Nano Drop2000定量后，采用SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA（試劑用量和操作均按說明書進行）。以β-actin為內(nèi)參，實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞p53、caspase-3、Bax、Bcl-2、JAK1、JAK2和STAT3的mRNA水平，經(jīng)2-ΔΔCt法計算，分析各mRNA的相對水平。引物序列見表1。

2.6 Western blot分析蛋白水平的變化用含有0 μg/L和25μg/L astragalin的培養(yǎng)液分別孵育OCI-LY8細(xì)胞24 h，離心棄上清液，用PBS洗3次，加入適量細(xì)胞裂解液，提取蛋白，經(jīng)蛋白定量試劑盒定量后以β-actin為內(nèi)參照進行Western blot，觀察OCI-LY8細(xì)胞p53、caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達及JAK1、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for RT-qPCR

2.7 抑瘤實驗取4周齡雄性BALB/c小鼠，隨機分為6組，每組10只。在無菌條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。取對數(shù)生長期的DLBCL細(xì)胞OCI-LY8，1 000 r/min離心5 min，去上清，PBS清洗3次，完全去上清液，將細(xì)胞沉淀并用生理鹽水稀釋成2×1010/L，于小鼠腹股溝皮下注射0.5 mL細(xì)胞懸液。注射3 d后，各組小鼠分別每天灌胃0、5、25、125、625和3 125 μg/kg劑量的astragalin，10 d后殺鼠，取瘤組織稱重，分析該藥的抑瘤作用。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間差異的比較用單因素方差分析，以P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Astragalin抑制OCI-LY8細(xì)胞的活力

分別經(jīng)0、1、5、25和125μg/L的astragalin作用OCI-LY8細(xì)胞0 h、24 h、48 h和72 h，結(jié)果如圖1所示，astragalin能顯著抑制OCI-LY8細(xì)胞的活力，且作用效果隨用藥劑量和用藥時間的增加而增強。

Figure 1.The results of viability by CCK-8 assay.OCI-LY8 cells were treated with 0，5，25 and 125μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μg/L group.圖1 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

2 Astragalin導(dǎo)致OCI-LY8細(xì)胞核型改變

經(jīng)0、5、25和125μg/L的astragalin分別作用OCI-LY8細(xì)胞24 h，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)5、25和125 μg/L astragalin作用后的OCI-LY8細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃集、核碎裂現(xiàn)象，形成凋亡小體，且作用效果隨用藥劑量的增加而增強。

3 Astragalin上調(diào)OCI-LY8細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平

分別經(jīng)0、5、25和125μg/L的astragalin作用OCI-LY8細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，astragalin可誘導(dǎo)OCI-LY8細(xì)胞凋亡，且作用效果隨用藥劑量的增加而增加（P＜0.01），見圖3。

4 Astragalin改變OCI-LY8細(xì)胞各基因的mRNA水平

經(jīng)25μg/L astragalin作用OCI-LY8細(xì)胞24h后，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)p53、caspase-3和Bax的mRNA水平顯著上調(diào)，而Bcl-2、JAK1、JAK2和STAT3的mRNA水平顯著下降（P＜0.01），見圖4。

Figure 3.The results of apoptotic rate examined by flow cytometry.OCI-LY8 cells were treated with 0～125μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs0μg/L group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果

5 Astragalin改變OCI-LY8細(xì)胞的蛋白水平

經(jīng)25μg/L astragalin作用OCI-LY8細(xì)胞24h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，astragalin可顯著上調(diào)OCI-LY8細(xì)胞內(nèi)p53、caspase-3和Bax蛋白水平，并下調(diào)蛋白Bcl-2的蛋白水平及JAK1、JAK2和STAT3的磷酸化水平，見圖5。

6 Astragalin抑制DLBCL生長

抑瘤實驗結(jié)果顯示，astragalin可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，且作用效果隨用藥劑量的增加而增強（P＜0.01），見圖6。

討 論

JAK/STAT信號通路主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK以及轉(zhuǎn)錄因子STAT三組分構(gòu)成［8］，近年來越來越多的資料證實，該信號通路可作為腫瘤治療藥物的靶點［9-11］。研究表明，JAK1和JAK2在經(jīng)某種外界刺激后的磷酸化水平受抑，而活性降低的JAK1和JAK2可抑制STAT3蛋白在細(xì)胞內(nèi)募集，并下調(diào)STAT3蛋白活性［12-13］，p-STAT3下降可改變線粒體跨膜蛋白，導(dǎo)致Bax與Bcl-2同源二聚體比例增加，增強線粒體膜的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C自線粒體中釋放出來，上調(diào)凋亡終末效應(yīng)分子caspase-3的表達水平，促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用［12-13］。

Figure 4.The results of RT-qPCR.OCI-LY8 cells were treated with 0 and 25μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs0μg/L group.圖4 RT-qPCR檢測結(jié)果

Figure 5.The results of Western blot.OCI-LY8 cells were treated with 0 and 25μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/L group.圖5 Western blot檢測結(jié)果

本實驗將astragalin作用于DLBCL細(xì)胞OCILY8，經(jīng)CCK-8法、Hoechst 33342染色和流式細(xì)胞術(shù)證實，astragalin可抑制OCI-LY8細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡。同時RT-qPCR以及Western blot實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)p53、caspase-3和Bax蛋白水平顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白含量及JAK1、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平顯著下降，因此，astragalin可抑制JAK/STAT信號通路的活化。同時當(dāng)astragalin作用于OCI-LY8細(xì)胞后，p53蛋白水平顯著上調(diào)。p53是一種抑癌基因，它不僅可以激活Fas和TNF介導(dǎo)的外源性凋亡途徑，同時能激活線粒體途徑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［14-15］。故而，在本研究中p53協(xié)同JAK/STAT信號通路發(fā)揮著抗DLBCL細(xì)胞OCI-LY8的作用。此外，小鼠抑瘤實驗也進一步證實astragalin的抑癌作用。

Figure6.The results of tumor inhibiting experiment.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs0μg/kg group.圖6 荷瘤小鼠抑瘤實驗檢測結(jié)果

綜上所述，astragalin可通過上調(diào)p53的表達和影響JAK/STAT信號通路，來抑制DLBCL細(xì)胞OCI-LY8活力，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，為抗DLBCL替代藥物的研發(fā)提供了重要依據(jù)。