嚴(yán) 培， 楊朝君， 穆怡含， 高 平， 鄧小寬

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610065)

1 引 言

淺部真菌病是由寄生在皮膚及肢體外的真菌感染而起的，此類皮膚病較頑固，不易根治，全世界約有20%～25%的人口受到影響，其中皮膚癬菌為主要的致病菌，而紅色毛癬菌 (Trichophytonrubrum)占皮膚癬菌的60%以上[1]. 目前臨床上多使用烯丙胺基和唑類抗真菌藥物，病原菌對該類藥物的耐藥性已逐漸增強[2]，因此研究尋找新型抗菌藥物便極為迫切. 中草藥來源廣泛，含抗真菌的化學(xué)成分多，不易產(chǎn)生耐藥性且毒副作用小，是探索新型抗真菌藥物的途徑之一[3]. 興安杜鵑葉(滿山紅)是我國用于治療支氣管炎及哮喘的常用中藥材，近些年的研究表明，興安杜鵑葉具有抑菌作用，其生物堿類和黃酮類物質(zhì)對多種細(xì)菌具有體外抑制作用[4-5]，但并未系統(tǒng)分析其具體成分，且對于興安杜鵑葉抑制皮膚癬菌的研究目前還未見報道. 本實驗室前期預(yù)實驗表明，興安杜鵑葉對紅色毛癬菌具有很好地體外抑制作用. 因此，本實驗通過液-液萃取法獲取興安杜鵑葉的不同萃取相，并結(jié)合對紅色毛癬菌的抑制活性研究，明確活性物質(zhì)主要分布部位. 采用硅膠柱層析、MCI柱層析、C18柱層析及高壓制備色譜柱層析等方法分離有效部位，獲取單體化合物并鑒定，結(jié)合抑菌活性確定具體活性成分，以期為開發(fā)新型抗真菌藥物奠定基礎(chǔ).

2.1 材 料

2.1.1 實驗材料 興安杜鵑葉購于成都市荷花池中藥材市場，由高平教授經(jīng)生藥學(xué)鑒別本品為杜鵑花科杜鵑花屬植物興安杜鵑RhododendrondauricumL.；鹽酸小檗堿、杜鵑素、萹蓄苷、槲皮素標(biāo)品(成都植標(biāo)化純生物有限公司)；氟康唑(上海麥克林生化科技有限公司).

紅色毛癬菌(T.rubrum，ATCC 28188)、近平滑念珠菌(ATCC 22019)由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室提供.

2.1.2 試 劑 所用試劑均為色譜純或分析純(成都科龍化工試劑廠)； SDA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基(北京威森特科技發(fā)展有限公司).

2.1.3 儀 器 小型粉碎機(鉑歐五金廠)；R201D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義英峪高科儀器廠)；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；光學(xué)顯微鏡(上海巴托儀器廠)；血球計數(shù)板(南通海銳實驗器材有限公司)；LC3000高效液相色譜儀(UV3000紫外檢測器、P3000高壓輸液泵，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Sepax Sapphire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；MCI GEL(上海廈美生化科技發(fā)展有限公司)；制備色譜柱(YMC-C18-10 μm)； MicrOTOF QⅡ、Bruker Avance Ⅱ-400/600 MHz spectrometer(德國Bruker公司).

2.2 方 法

2.2.1 化學(xué)成分的提取 取興安杜鵑葉粉末5 kg，加甲醇溶液滲漉提取，減壓濃縮滲漉液得粗提物浸膏(Crude extract，CT)770 g. 將CT用適量熱水分散，依次加入石油醚(Petroleum ether，PE)、乙酸乙酯(Ethyl acetate，EA)和正丁醇(Butyl alcohol，BA)萃取，每相萃取三次，合并每相萃取液，減壓濃縮得PE(231 g)、EA(203 g)、BA(101 g)、W(279 g)四段萃取物浸膏，用二甲亞砜配置成50 mg·mL-1的藥液，打孔法測定抑菌活性.

2.2.2 活性物質(zhì)的分離 根據(jù)抑菌活性篩選結(jié)果，將EA萃取物浸膏用適量甲醇溶解，加入硅膠拌勻，濕法上柱，干法上樣. 用石油醚、乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸配制成不同極性大小的洗脫劑，由小到大梯度洗脫，收集洗脫液，經(jīng)TLC檢測后合并相同組分，減壓濃縮得到Fr.1(10 g)、Fr.2(9 g)、Fr.3(24 g)、Fr.4(9 g)、Fr.5(12 g)、Fr.6(30 g)、Fr.7(37 g)、Fr.8(20 g)、Fr.9(15 g)、Fr.10(22 g)共10個活性段浸膏，F(xiàn)r.3濃縮后結(jié)出晶體，石油醚反復(fù)重結(jié)晶后得到化合物1(4.7 g). 抑菌活性測定結(jié)果顯示Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9四個活性段效果最好，將四段分別用少量二甲亞砜溶解后，過MCI柱脫色素，80%甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮. 其中Fr.9濃縮后析出晶體，反復(fù)重結(jié)晶后得到化合物16(421 mg)，母液經(jīng)HPLC檢測后未發(fā)現(xiàn)其他含量較多成分，不再分離. Fr.6過C18柱，40%-60%甲醇溶液梯度洗脫，得到化合物2(850 mg)和Fr.6-1、Fr.6-2組分；Fr.6-1繼續(xù)過C18柱，10%～15%甲醇溶液梯度洗脫，得到化合物3(19 mg)、4(48 mg)、5(54 mg)；Fr.6-2未能分出較純的化合物單體. Fr.7經(jīng)C18柱，20%～80%甲醇溶液梯度洗脫，得到Fr.7-1、Fr.7-2、Fr.7-3、Fr.7-4四個組分，其中，經(jīng)HPLC檢測，F(xiàn)r.7-3組分為化合物2；Fr.7-1繼續(xù)過C18柱，5%～10%甲醇溶液梯度洗脫，得到化合物6(507 mg)、10(18 mg)、11(22 mg)；Fr.7-2經(jīng)高壓制備色譜柱，5%～15%甲醇溶液梯度洗脫，得到化合物7(19 mg)；Fr.7-4經(jīng)高壓制備色譜柱，得到化合物8(10 mg)、9(14 mg). Fr.8經(jīng)C18柱，20%～80%甲醇溶液梯度洗脫，得到Fr.8-1、Fr.8-2、Fr.8-3三個組分，其中，從Fr.8-1中未能分離出純度高的化合物；Fr.8-2經(jīng)高壓制備色譜柱，5%～20%甲醇溶液梯度洗脫，得到化合物12(33 mg)、13(567 mg)；Fr.8-3經(jīng)高壓制備色譜柱，得到化合物14(19 mg)、15(21 mg). 將化合物1～16用二甲亞砜配置成10 mg·mL-1的藥液，打孔法測定抑菌活性.

2.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 根據(jù)化合物1～16的MS、NMR、HPLC結(jié)果，結(jié)合相關(guān)文獻解析化合物結(jié)構(gòu).

2.2.4 菌懸液的制備 挑取紅色毛癬菌菌絲于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下活化培養(yǎng)7～14 d，用生理鹽水洗下孢子，血球計數(shù)板計數(shù)后，用生理鹽水稀釋配置成濃度為5×106～10×106CFU·mL-1的菌懸液用于打孔法測定；用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成相同濃度用于最小抑菌濃度測定.

2.2.5 抑菌活性測定(打孔法) 吸取100 μL菌懸液于SDA培養(yǎng)基上，涂布均勻，用直徑為 0.6 cm打孔器打孔，挑掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，向孔中添加100 μL藥液，各藥液設(shè)置三個重復(fù)，二甲亞砜作為空白對照，將接種好的培養(yǎng)基置于28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察紅色毛癬菌生長情況，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，使用軟件IBM SPSS Statistics 23和GraphPad Prism8.0比較各藥液的抑菌活性高低，分析各組數(shù)據(jù)間的顯著性關(guān)系并繪圖.

2.2.6 最小抑菌濃度(MIC80)測定 參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 ( CLSI) 2008 年推薦的 《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》 ( M38-A2) 進行測定[6]. 將化合物2、6、7先用二甲亞砜溶解，再用RPMI-1640培養(yǎng)基倍比稀釋成2倍終濃度，終濃度由高到低依次為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125 mg·mL-1，分別添加至無菌96孔板的第1～3列，第4列添加同樣梯度濃度的鹽酸小檗堿為陽性對照，第5列添加含二甲亞砜的RPMI-1640培養(yǎng)基為生長對照. 在每孔中添加100 μL菌懸液，混勻后放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7～14 d，讀取結(jié)果. 結(jié)果需由2人肉眼判斷，與生長對照孔對比，將菌液略模糊(生長抑制≥80%)的最小濃度記為該化合物的最小抑菌濃度(MIC80). 質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌(ATCC 22019)，質(zhì)控藥物為氟康唑.

2.2.7 最小殺菌濃度(MBC)測定 從上述濃度高于MIC80的96孔板里吸取100 μL于SDA培養(yǎng)基中，涂布均勻，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察有無菌落生長，取無菌落生長的最小濃度記為該化合物的最小殺菌濃度(MBC).

3 結(jié)果與分析

3.1 興安杜鵑葉不同萃取相對紅色毛癬菌的抑制活性

采用打孔法測定興安杜鵑葉不同萃取相對紅色毛癬菌的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖1A所示，與空白對照組(CK)相比，除W相沒有抑制活性外，其余三相均對紅色毛癬菌有一定抑制活性. 打孔法測得抑菌圈直徑越大，表明抑制活性越強，將抑菌圈直徑進行顯著性分析得到圖1B，EA相的抑制活性顯著高于PE相和BA相；與CT相比，EA相的抑制活性也顯著高于CT，而PE相和BA相均顯著低于CT. 因此，興安杜鵑葉中的抑菌活性物質(zhì)主要集中在EA相，將EA相作為樣品進行后續(xù)實驗.

圖1 興安杜鵑葉不同萃取相對紅色毛癬菌的抑菌結(jié)果

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

從EA相的Fr.6～ Fr.9中分離得到16個化合物，經(jīng)鑒定為：

化合物1：白色粉末.ESI-MS at m/z：369.11[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[7]基本一致，故鑒定該化合物為Daurichromenic acid，分子式為C23H30O4.

化合物2：淡黃色晶體.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物出峰時間與杜鵑素標(biāo)品一致，且混合進樣顯示為同一物質(zhì)，故鑒定該化合物為杜鵑素(farrerol)，分子式為C17H16O5.

化合物3：白色結(jié)晶.ESI-MS at m/z：167.15[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[8]基本一致，故鑒定該化合物為香莢蘭酸(vanillic acid)，分子式為C8H8O4.

化合物4：淺黃色粉末.ESI-MS at m/z：303.25[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[9]基本一致，故鑒定該化合物為二氫槲皮素(taxifolin)，分子式為C15H12O7.

化合物5：白色粉末.ESI-MS at m/z：136.95[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致，故鑒定該化合物為對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)，分子式為C7H6O3.

化合物6：白色針狀結(jié)晶.ESI-MS at m/z：163.00[M+H]+，160.88[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[11]基本一致，故鑒定該化合物為傘形花內(nèi)酯(umbelliferone)，分子式為C9H6O3.

化合物7：淺棕色針晶.ESI-MS at m/z：193.08[M+H]+，190.95[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[12]基本一致，故鑒定該化合物為去甲丁香色原酮(2-Methyl-5,7-dihydroxychromone)，分子式為C10H8O4.

化合物8：白色粉末.ESI-MS at m/z：471.7[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，故鑒定該化合物為山楂酸(Maslinic acid)，分子式為C30H48O4.

化合物9：白色粉末.ESI-MS at m/z：471.8[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[14]基本一致，故鑒定該化合物為科羅索酸(corosolic acid)，分子式為C30H48O4.

化合物10：黃色固體.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物出峰時間與萹蓄苷標(biāo)品一致，且混合進樣顯示為同一物質(zhì)，故鑒定該化合物為萹蓄苷(avicularin)，分子式為C20H18O11.

化合物11：白色結(jié)晶.ESI-MS at m/z：197.18[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[15]基本一致，故鑒定該化合物為丁香酸(syringic acid)，分子式為C9H10O5.

化合物12：淡黃色針狀結(jié)晶.ESI-MS at m/z:285.24[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[16]基本一致，故鑒定該化合物為山奈酚(kaempferol)，分子式為C15H10O6.

化合物13：黃色粉末.HPLC檢測結(jié)果顯示該化合物出峰時間與槲皮素標(biāo)品一致，且混合進樣顯示為同一物質(zhì)，故鑒定該化合物為槲皮素(quercetin)，分子式為C15H10O7.

化合物14：白色結(jié)晶.ESI-MS at m/z：455.69[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[17]基本一致，故鑒定該化合物為熊果酸(ursolic acid)，分子式為C30H48O3.

化合物15：白色結(jié)晶.ESI-MS at m/z：455.71[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[17]基本一致，故鑒定該化合物為齊墩果酸(oleanolic acid)，分子式為C30H48O3.

化合物16：黃色粉末.ESI-MS at m/z：435.12[M+H]+，432.93[M-H]-，NMR數(shù)據(jù)與文獻[17]基本一致，故鑒定該化合物為槲皮素-3-O-β-D-呋喃木糖苷(Quercetin -3-O-β-D-xylofuranoside)，分子式為C20H18O11.

3.3 單體化合物對紅色毛癬菌的抑菌活性

采用打孔法測定單體化合物對紅色毛癬菌的抑制活性，結(jié)果如圖2所示. 與CK相比，杜鵑素、傘形花內(nèi)酯等7個單體化合物均對紅色毛癬菌有一定抑制活性，將這7個單體化合物的抑菌圈直徑和EA相進行顯著性分析比較，結(jié)果見圖3. 杜鵑素、傘形花內(nèi)酯和去甲丁香色原酮的抑菌活性均顯著高于EA相，表明興安杜鵑葉中對紅色毛癬菌有抑制活性的單體化合物主要為杜鵑素、傘形花內(nèi)酯、去甲丁香色原酮，其中傘形花內(nèi)酯的抑菌活性最強.

圖2 單體化合物對紅色毛癬菌的抑菌結(jié)果Fig.2 The bacteriostasis results of monomer compounds to T.rubrum

圖3 單體化合物對紅色毛癬菌的抑菌圈直徑比較

a～g indicates there have significant difference(P<0.05)between the groups.

3.4 單體化合物MIC80和MBC結(jié)果

通過M38-A2法測定3個主要活性物質(zhì)對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，并與鹽酸小檗堿比較，結(jié)果見表1.

表1 主要活性物質(zhì)對紅色毛癬菌的MIC80值和MBC值

杜鵑素、傘形花內(nèi)酯和去甲丁香色原酮對紅色毛癬菌的MIC80值分別為0.312 5、0.156 25、0.312 5 mg·mL-1，MBC值分別為1.25、1.25、5 mg·mL-1；陽性對照鹽酸小檗堿的MIC80值為0.156 25 mg·mL-1，MBC值為5 mg·mL-1. 故此，傘形花內(nèi)酯的抑菌活性與鹽酸小檗堿相當(dāng)，而杜鵑素和傘形花內(nèi)酯的殺菌活性均強于鹽酸小檗堿.

4 討 論

打孔法和CLSI M38-A2方案是檢測藥液體外抑制產(chǎn)孢絲狀真菌的常用方法. 對于色素含量較多，用M38-A方案不便于直接觀察菌絲生長情況的藥液，用打孔法可直觀比較結(jié)果，操作便捷，且與濾紙片法、牛津杯法相比，打孔法具有可定量藥液，重復(fù)性好，成本低廉的優(yōu)點. 因此，本實驗采用打孔法比較實驗過程中各藥液的抑菌活性. 但打孔法只能比較本實驗中各藥液間的抑菌活性，而M38-A2方案是一個測定絲狀真菌對不同藥液敏感性的標(biāo)準(zhǔn)化程序，可使不同實驗室測定的各藥液抗真菌活性結(jié)果具有可比性或可重復(fù)性[18]. 因此，采用M38-A2方案測定本實驗得到的主要活性物質(zhì)對紅色毛癬菌的MIC80值.

本實驗從興安杜鵑葉的乙酸乙酯萃取物中分離鑒定出16個化合物，其中，化合物7～9為首次從該植物中分離得到，此結(jié)果拓寬了對興安杜鵑葉物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識. 抑菌活性測定結(jié)果表明，化合物1～3、5～7、11均對紅色毛癬菌有一定抑制活性，其中，化合物2、6、7的抑制活性最好，此研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了興安杜鵑葉中多種成分的抗皮膚癬菌活性，并明確其主要活性物質(zhì)為杜鵑素、傘形花內(nèi)酯和去甲丁香色原酮. 紅色毛癬菌是最常見的皮膚癬菌，從天然藥用植物中篩選抗皮膚癬菌成分受到研究者的廣泛重視. 在對藥用植物抗菌成分的篩選研究中，桑枝中篩選出的氧化白藜蘆醇對紅色毛癬菌的MIC為0.5 mg·mL-1[19]，植物中廣泛存在的芳樟醇對紅色毛癬菌的MIC為0.32 mg·mL-1[1]；而在藥用植物有效部位對紅色毛癬菌的抑制活性研究中，黃連的正丁醇萃取物比其他溶劑萃取物抑制效果更強，其MIC為0.125～0.25 mg·mL-1[20]，香鱗毛蕨中間苯三酚類物質(zhì)對紅色毛癬菌的MIC為0.312 5～5 mg·mL-1[21]；除此之外，鳳仙花、馬齒莧[22]、水翁皮[23]、苦參、土荊皮和白癬皮[24]等多種藥用植物粗提物對抗紅色毛癬菌的MIC在1.509～62.5 mg·mL-1之間. 本實驗結(jié)果顯示，興安杜鵑葉中杜鵑素、傘形花內(nèi)酯和去甲丁香色原酮對紅色毛癬菌的MIC80為0.156 25～0.312 5 mg·mL-1，與其他的植物成分相比，以上物質(zhì)抑制活性較強.

本實驗僅對乙酸乙酯萃取物中抑菌活性最顯著的Fr.6～Fr.9的物質(zhì)進行了分離和篩選，對抑菌活性稍弱的石油醚萃取物、正丁醇萃取物及乙酸乙酯萃取物中其他活性段的成分未有研究，其中是否含有其他活性成分還有待進一步探討. 同時，對活性成分抗紅色毛癬菌的作用機理也需更深入的研究.