唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)功效組分地理變異及氣候響應(yīng)特征

楊芙蓉,冉家棟,劉海濤,宋經(jīng)元,謝彩香,*

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 國家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護重點研究室, 北京 100193 2 中藥資源教育部工程研究中心, 北京 100193

唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)為蓼科大黃屬(RheumLinn.)多年生高大草本植物,為中藥材大黃的原植物之一,青海省是其著名的道地產(chǎn)區(qū)。唐古特大黃的藥用歷史悠久,具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,與這三種主要功效相關(guān)的活性成分可分為四類,即具有抑菌功效的游離蒽醌類成分,具有瀉下功效的結(jié)合蒽醌類成分和雙蒽酮類成分,具有抗凝血功效的多酚類成分(主要是沒食子酸和兒茶素)[2- 6]。大黃為我國傳統(tǒng)常用大宗中藥材,《中華人民共和國藥典》(2015版)收載的含大黃成分的中成藥多達105種,全國中藥制劑中含有大黃成分的比例高達10%[7]。

藥用資源化學(xué)成分的種類及含量的地域性差異是中藥材道地性的一種具體體現(xiàn)。特定生態(tài)環(huán)境條件與遺傳基因相輔相成,充分體現(xiàn)了中藥的特殊性、地道性和繼承性?！侗静萁?jīng)集注》“諸藥所生,皆有境界”,《唐本草》“離其本土,則質(zhì)同而效異”,這些記載都說明了生態(tài)環(huán)境對中藥品質(zhì)影響的重要性。有研究者認為“物種內(nèi)質(zhì)量變異有時大于種間差異”是現(xiàn)代道地論的核心思想[8]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的唐古特大黃其功效組分含量有顯著差異,且化學(xué)成分與環(huán)境因子間存在強關(guān)聯(lián)性[9]。大黃是多道地產(chǎn)區(qū)藥用植物的典型代表,青海和甘肅是唐古特大黃和掌葉大黃(RheumpalmatumL.)的主產(chǎn)區(qū)。因此,唐古特大黃品質(zhì)地域性以及與產(chǎn)地氣候間的響應(yīng)關(guān)系是闡釋唐古特大黃道地性的重要環(huán)節(jié)。

古人用產(chǎn)地作為道地藥材品質(zhì)的映射體現(xiàn)出整體性思想,藥材的道地性成因是中醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點。目前,對中藥道地性形成的環(huán)境因子和生物因子等雖有所研究,但往往是針對個別因子的單因子影響研究,缺乏對環(huán)境因子的綜合性和系統(tǒng)性研究[10-20]。目前,對不同產(chǎn)區(qū)大黃的成分差異及炮制方法,資源分布以及藥理研究較多[21- 28],但對影響唐古特大黃品質(zhì)形成的氣候因子和響應(yīng)特征的研究還比較少[29- 30],尤其是尚未見到有關(guān)唐古特大黃與多尺度氣候因子的系統(tǒng)性研究。因此,本文基于不同產(chǎn)地唐古特大黃的功效組分含量對多產(chǎn)地的唐古特大黃進行生態(tài)型劃分,并基于多尺度氣候因子和多種數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法,系統(tǒng)研究氣候因子與唐古特大黃品質(zhì)的響應(yīng)特征,明確道地藥材唐古特大黃的氣候響應(yīng)特征,探索唐古特大黃品質(zhì)地理變異的氣候成因,揭示大黃不同化學(xué)生態(tài)型形成的生態(tài)學(xué)機制,為唐古特大黃高品質(zhì)種植區(qū)選址及其資源可持續(xù)發(fā)展提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1唐古特大黃樣本

文中關(guān)于唐古特大黃樣本點信息和化學(xué)功效組分含量的數(shù)據(jù)引自李莉?qū)Σ煌赖禺a(chǎn)區(qū)大黃藥材質(zhì)量特征的研究結(jié)果[31]。本文調(diào)查的唐古特大黃樣本點共11批,分別來自于大黃的主要產(chǎn)區(qū)四川、甘肅、寧夏、青海省。研究樣本的采樣信息見表1,樣本點分布圖見圖1。

表1 唐古特大黃樣本點地理信息表

圖1 唐古特大黃采樣點Fig.1 Sampling localities of Rheum tanguticum

1.1.2氣候數(shù)據(jù)

本文所采用的氣候數(shù)據(jù)包含三個時間尺度(表2),首先是4個年均因子,來源于中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)共享平臺；其次是17個反映季節(jié)性變化的綜合氣候因子,來源于世界氣候數(shù)據(jù)庫(http://www. worldclim.org/),為1970—2000年監(jiān)測數(shù)據(jù)的平均值,空間分辨率為2.5 min；然后是4個月均因子,反映溫度、降水和日照等因子在月際間的動態(tài)變化。

表2 環(huán)境變量

1.2 方法

1.2.1唐古特大黃品質(zhì)測定

采用HPLC法測定唐古特大黃樣品中游離蒽醌類(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)、總蒽醌(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)、結(jié)合蒽醌(總蒽醌含量-游離蒽醌含量)、多酚類(沒食子酸、兒茶素)、雙蒽酮苷類(番瀉苷A、番瀉苷B)等組分含量。Agilent1100高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測器),色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0—10 min,5%B—11%B；10—30 min,11%B—15%B；30—45 min,15%B—17%B；45—60 min,17%B—22%B；60—75 min,22%B—36%B；75—90 min,36%B—60%B；90—105 min,60%B；105—110 min,60%—5%B)；流速1.0 mL/min1；檢測波長 250nm;柱溫40℃；進樣量10μL。

1.2.2數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 25.0進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析,運用Matlab、Prism 8.0進行圖表繪制。用 Analyze-Descriptive Statistics 法標準化處理不同量綱數(shù)據(jù),得到標準化結(jié)果后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。聚類分析將數(shù)據(jù)線性標準化后采用系統(tǒng)聚類法,分析方法采用組間聯(lián)結(jié)和Pearson距離法。相關(guān)性分析采用SPSS中Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特大黃品質(zhì)地理變異

不同產(chǎn)地間唐古特大黃4種功效組分間的含量具有明顯的地理變異(表3)。圖2顯示青海和甘肅所產(chǎn)唐古特大黃聚成一類,四川產(chǎn)唐古特大黃單獨成一類。圖3顯示不同地區(qū)唐古特大黃4種功效組分含量有顯著性變化,尤其是游離蒽醌類、結(jié)合蒽醌類和多酚類化學(xué)物質(zhì)含量隨地域變化很大。根據(jù)4種功效組分含量,唐古特大黃可劃分為青海-甘肅型和四川型兩種化學(xué)生態(tài)型。其中青海-甘肅型中結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)含量比較高,而四川型中游離蒽醌含量比較高。青海-甘肅型中結(jié)合蒽醌類含量比例為66.9%,而四川型中游離蒽醌類含量比例為70%。圖4顯示不同地區(qū)大黃多酚類成分也具有明顯地理變異,其中青海-甘肅型樣本中多酚類成分含量高于四川型樣本,而雙蒽酮類成分沒有明顯的地域差異。

圖4 唐古特大黃4種功效組分含量熱圖Fig.4 The heatmap of functional compositions in Rheum tanguticum

表3 唐古特大黃樣本組分含量結(jié)果/%

圖2 唐古特大黃化學(xué)成分聚類圖 Fig.2 The cluster diagram of chemical compositions of Rheum tanguticum S-SP: 四川松潘, S-TK: 四川唐克, S-DG: 四川德格, Q-JZ: 青海久治, Q-QL: 青海祁連, Q-GD: 青海貴德, Q-TD: 青海同德, Q-DR: 青海達日, Q-MQ: 青海瑪沁, G-XH: 甘肅夏河, G-TZ：甘肅天祝

圖3 唐古特大黃4種功效組分含量堆積圖Fig.3 The stacked bar of function compositions

2.2 唐古特大黃品質(zhì)對氣候因子的響應(yīng)

基于年-季-月不同時間尺度的氣候因子,逐次分析唐古特大黃品質(zhì)與氣候因子間的響應(yīng)關(guān)系。

2.2.1年均氣候因子

圖5顯示唐古特大黃4種成分與年均日照時數(shù)呈正相關(guān)。游離蒽醌類物質(zhì)與4個年均氣候因子相關(guān)性最弱,其次是雙蒽酮類物質(zhì),而結(jié)合蒽醌類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)與4個年均氣候因子都有一定的相關(guān)性。

圖5 唐古特大黃功效成分與年均因子相關(guān)性的冗余分析 Fig.5 Analysis (RDA) of relationships between functional composition in Rheum tanguticum and annual factors

表4可知結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)與4種年均因子有較大相關(guān)性。其中,結(jié)合蒽醌類物質(zhì)與年均溫呈顯著負相關(guān)；多酚類物質(zhì)與年均溫和年降水呈負相關(guān),而與日照正相關(guān)。說明低溫少雨且日照時間長的地區(qū)適宜結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)的產(chǎn)生與積累。

表4 唐古特大黃4種功效組分與年均氣候因子的相關(guān)系數(shù)

2.2.2季度氣候因子

表5說明四類組分中只有結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)與氣候因子間有一定相關(guān)性,這與2.2.1中結(jié)論是一致的。

表5 唐古特大黃4種功效組分與季度氣候因子間的相關(guān)系數(shù)

在0.01水平上,與結(jié)合蒽醌類物質(zhì)具有顯著負相關(guān)的氣候因子Bio 9(最干季平均溫度)、Bio 11(最冷季平均溫度),說明低溫有利于結(jié)合蒽醌類物質(zhì)的累積；在0.05水平上,與結(jié)合蒽醌類物質(zhì)具有負相關(guān)性的氣候因子有Bio 3(等溫性)、Bio 5(最熱月份最高溫)、Bio 6(最冷月份最低溫)、Bio 10(最熱季平均溫度),說明溫度變化劇烈的地區(qū)有助于結(jié)合蒽醌類物質(zhì)的積累,最熱月份和最冷月份溫度越低對結(jié)合蒽醌物質(zhì)形成越有利；而與Bio 4(溫度季節(jié)性變化系數(shù))呈現(xiàn)顯著正相關(guān),說明溫度變化劇烈有利于結(jié)合蒽醌物質(zhì)形成。

在0.01水平上,多酚類物質(zhì)與Bio 3(等溫性)負相關(guān),與Bio 4(溫度季節(jié)性變化系數(shù))正相關(guān),說明一年中的溫度變化劇烈有利于多酚類物質(zhì)形成。在0.05水平上,與多酚類物質(zhì)具有顯著負相關(guān)的氣候因子為Bio 2(晝夜溫差月均值)、Bio 9(最干季平均溫度)、Bio 11(最冷季平均溫度)、Bio 16(最濕季降雨量)、Bio 18(最暖季降雨量),說明晝夜溫差大和最冷季的低溫有助于多酚類物質(zhì)累積,同時降水量越少越有助于多酚類物質(zhì)形成。

總之,溫差大(晝夜溫差,季節(jié)溫差),溫度低且降水量少的區(qū)域有助于唐古特大黃中結(jié)合蒽醌類和多酚類物質(zhì)的形成和累積。

2.2.3月均因子

通過2.2.1和2.2.2研究表明,降水量、均溫和日照均影響唐古特大黃的組分形成,為深入研究氣候因子對各成分的動態(tài)影響,進一步分析在月均尺度上三個因子與唐古特大黃功效組分間的相關(guān)性,結(jié)果見表6、圖6、表7。表6顯示除了游離蒽醌與每月平均氣溫(7月和8月除外)呈現(xiàn)正相關(guān)外,其他三種功效組分與每月平均氣溫都是負相關(guān),符合2.2.1部分結(jié)論。其中,與結(jié)合蒽醌類物質(zhì)呈強負相關(guān)的是1月至6月氣溫和9月至12月氣溫,說明最干季節(jié)的低溫對結(jié)合蒽醌累積有利。而月氣溫對多酚類物質(zhì)的影響不顯著,只有1月至4月氣溫和12月氣溫低溫對多酚類物質(zhì)累積有促進作用。

表6 唐古特大黃4種功效組分與月平均氣溫的相關(guān)系數(shù)

圖6說明每月平均降水量只有對多酚類物質(zhì)有一定的響應(yīng)。多酚類物質(zhì)與6—7月平均降水量、9—10月平均降水量呈負相關(guān),說明在最濕季降水量越少越有助于多酚類物質(zhì)形成。

圖6 唐古特大黃4種功效組分與月平均降水量的相關(guān)系數(shù) Fig.6 Heatmap for correlation analysis of monthly average precipitation and functional compositions in Rheum tanguticumPrec1—12:1—12月月均降水量；* 0.05級別(雙尾)相關(guān)性顯著；* * 0.01級別(雙尾)相關(guān)性顯著

表7說明,每月平均日照量與結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)都呈正相關(guān)。尤其是多酚類物質(zhì)在唐古特大黃生長季節(jié)呈現(xiàn)出與日照的強正相關(guān)性,說明在唐古特大黃的生長季,日照量對多酚類物質(zhì)累積有促進作用。

表7 唐古特大黃4種功效組分與月平均日照量的相關(guān)系數(shù)

2.3 大黃不同品質(zhì)區(qū)氣候特征

上述研究結(jié)果說明,只有月均溫和月均日照量與結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)呈強相關(guān)性。因此,通過分析這兩種因子在唐古特大黃不同品質(zhì)區(qū)的氣候差異,以期獲得唐古特大黃不同品質(zhì)區(qū)的氣候特征。

圖7顯示兩區(qū)域的月均溫差呈現(xiàn)大-小-大的漏斗形,即1到4月份溫差較大,而從5月到8月兩區(qū)域間的溫差變小,從9月到12月溫差又變大。說明影響結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)累積的主要時間窗口(最冷季)內(nèi),兩區(qū)域間的月均溫有較大差異。圖8顯示青海-甘肅區(qū)域內(nèi)的每個月的月均日照量都高于四川區(qū)域,但在5—8月份期間,兩地區(qū)間差值較小。根據(jù)表5和表6的結(jié)論,最冷季月均溫與結(jié)合蒽醌物質(zhì)和多酚類物質(zhì)均呈負相關(guān),而每月日照量與多酚類物質(zhì)呈正相關(guān),青海-甘肅地區(qū)由于最冷季(1至5月份,9至12月份)每月平均氣溫遠低于四川地區(qū),且每月日照量均高于四川地區(qū),所以青海-甘肅地區(qū)結(jié)合蒽醌物質(zhì)和多酚類物質(zhì)含量高于四川地區(qū),這恰恰闡釋了青海-甘肅地區(qū)和四川地區(qū)的唐古特大黃品質(zhì)存在差異的氣候原因。

圖7 不同地區(qū)月均溫箱線圖Fig.7 Boxplot of monthly average temperature in different regions

圖8 不同地區(qū)月均日照量箱線圖Fig.8 Boxplot of monthly average solar radiation in different regions

3 討論

藥用植物化學(xué)成分含量的地域性差異是中藥材道地性的一種具體體現(xiàn)?！爱a(chǎn)之有地,采之有時,清潔加工,依古炮制”,說明一定的產(chǎn)地環(huán)境是保障道地藥材好品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)[32]。

3.1 唐古特大黃化學(xué)成分地理變異

除雙蒽酮類成分外,不同產(chǎn)地間唐古特大黃中功效組分含量具有明顯的地理變異,可劃分為青海-甘肅型和四川型兩種化學(xué)生態(tài)型。其中,青海-甘肅型中結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)含量比較高,而四川型是游離蒽醌含量比較高。由于大黃泄下功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是結(jié)合蒽醌類物質(zhì),因此,青海和甘肅地區(qū)唐古特大黃的泄下功效比較強[33- 34]。

3.2 唐古特大黃品質(zhì)與氣候因子的響應(yīng)

本文首次采用不同時間尺度的氣候因子,研究影響唐古特大黃品質(zhì)形成的關(guān)鍵氣候因子和主要時間窗口。

(1)在年均因子層次上,結(jié)合蒽醌和多酚類2種組分與4種年均因子具有一定的相關(guān)性。低溫少雨且日照時間長的地區(qū)適宜結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)的積累。由于甘肅-青海和四川地區(qū)在溫度、日照和降水方面的差異,導(dǎo)致了不同地區(qū)唐古特大黃在結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)含量存在明顯差異。

(2)在季均因子層次上,溫度變化劇烈且最冷季度時(最干季度)溫度低的地區(qū),有利于結(jié)合蒽醌類物質(zhì)的累積。同時,溫度變化幅度大(晝夜溫差、季節(jié)性浮動),最冷季溫度低且降水量少的地區(qū),有助于多酚類物質(zhì)形成。這與年均尺度因子結(jié)論一致。

(3)在月均因子層次上,只有結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)與月均溫度因子和日照因子間具有強相關(guān)性,這一結(jié)論在三個時間尺度上具有一致性。結(jié)果表明,最冷季度時溫度越低越有利于結(jié)合蒽醌類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)的累積。每月平均日照量與結(jié)合蒽醌和多酚類物質(zhì)都呈正相關(guān),尤其是對多酚類物質(zhì)影響最大。相關(guān)性研究數(shù)據(jù)表明,多酚類物質(zhì)在唐古特大黃生長季節(jié)呈現(xiàn)出與日照的強正相關(guān)性,說明在唐古特大黃的生長季,高日照量對多酚類物質(zhì)累積有促進作用。

總而言之,月均溫和月均日照量是導(dǎo)致青海-甘肅和四川兩個產(chǎn)區(qū)唐古特大黃品質(zhì)差異的主要氣候原因,且兩地區(qū)間氣候差異的主要時間窗口為1—6月份和9—12月份。這與車國東等[35]所研究栽培唐古特大黃蒽醌含量的季節(jié)動態(tài)變化結(jié)果相一致。本文基于多層次氣候因子的相關(guān)性研究結(jié)果,探討了道地藥材唐古特大品質(zhì)地域差異的氣候成因。

3.3 唐古特大黃品質(zhì)形成因素探討及研究展望

中藥材品質(zhì)的形成受環(huán)境、遺傳等諸多因素的影響。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同道地產(chǎn)區(qū)唐古特大黃藥材質(zhì)量產(chǎn)生差異的原因與其遺傳背景差異有關(guān)系[36- 37]。此外,有學(xué)者認為環(huán)境是影響唐古特大黃組分的主要因素,其次才是種源[38]。而環(huán)境主要是包括氣候和土壤因素,土壤對藥用植物的生長發(fā)育、活性成分的合成積累有較大影響[39]。有研究表明藥用植物鎖陽兩個道地產(chǎn)區(qū)土壤微生物群落存在多樣性差異[40]；不同的土壤營養(yǎng)元素和無機元素差異導(dǎo)致大黃藥材功效組分間的含量有顯著差異,這也進一步說明土壤因素也是形成藥材道地性的主導(dǎo)因子[41]。由此可知,不同地區(qū)的氣候和土壤條件差異是導(dǎo)致藥材品質(zhì)區(qū)域變異的主要生態(tài)因素。本文著重從多層次氣候因子角度深入研究造成唐古特大黃品質(zhì)差異的氣候原因,探索影響唐古特大黃品質(zhì)形成的關(guān)鍵氣候因子和主要時間窗口,在后續(xù)的唐古特大黃品質(zhì)研究中會繼續(xù)考慮土壤條件對唐古特大黃品質(zhì)的影響。同時,進一步對唐古特大黃進行代謝組學(xué)研究和產(chǎn)區(qū)試種,期望全面揭示唐古特大黃道地性的生態(tài)機制。