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      黎藥裸花紫珠散劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

      2021-06-03 09:28:02周欣欣張俊清賴偉勇
      關(guān)鍵詞:裸花紫珠草苷

      侯 杰,周欣欣,張俊清,2,賴偉勇,2

      (1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,海南 ???71199;2.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ???71199;3.哈爾濱工商大學(xué),黑龍江 哈爾濱150076)

      裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.ex Arn.)是馬鞭草科紫珠屬植物,主要分布于我國(guó)廣東、廣西和海南等地?,F(xiàn)代藥理活性研究表明裸花紫珠中黃酮類和三萜及其苷類、苯丙素苷和環(huán)烯醚萜苷為其主要成分[1]。裸花紫珠具有止血、抗炎、抑菌、增強(qiáng)免疫、細(xì)胞毒等作用[2-5]。裸花紫珠的止血抗炎功效被得到了廣泛研究,利用裸花紫珠研制止血膏劑、噴霧劑等[4,6],并對(duì)不同止血?jiǎng)┬瓦M(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本研究從裸花紫珠散劑的鑒別(薄層色譜)、重金屬及有害元素限量檢查、主要有效成分含量檢測(cè)(高效液相色譜)等方面較系統(tǒng)研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為裸花紫珠散劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      裸花紫珠散劑(課題組制備),甲醇、乙酸乙酯、三氯化鋁、乙醇、鹽酸、硫脲、抗壞血酸、高氯酸、硝酸、鐵氰化鉀均為分析純,甲酸、乙腈為色譜純。木犀草苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品;砷(As)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鎘(Cd)、銅(Cu)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心);砷、鉛、汞、鎘、銅元素?zé)簟?/p>

      1.2 儀器與設(shè)備

      原子吸收光譜儀(ICE3000賽默飛美國(guó))、原子熒光光譜儀(AFS-830北京)、高效液相色譜儀(waterse2695美國(guó))

      1.3 方法

      1.3.1 裸花紫珠散劑薄層鑒別項(xiàng)的建立 供試品溶液的制備:取三批裸花紫珠散劑各1 g,分別放入25 mL容量瓶中,加甲醇定容至25 mL,超聲30 min。放冷,用甲醇補(bǔ)足。搖勻,濾過(guò),取濾液,即得。

      對(duì)照品溶液的制備:精密稱取木犀草苷對(duì)照品,加甲醇配置成0.2 mg/mL的木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為木犀草苷對(duì)照品溶液。精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品,加甲醇配置成1.0 mg/mL的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液。

      薄層鑒別方法:取上述方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液,分別點(diǎn)于同一0.5%NaOH硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯∶甲酸∶水(28∶2∶3)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出晾干,噴以3%三氯化鋁乙醇溶液,105℃加熱5 min,于紫外光(365 nm)下檢視。

      專屬性實(shí)驗(yàn):取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對(duì)照品溶液,空白溶液(甲醇),按照上述方法做薄層鑒別實(shí)驗(yàn)兩次,記錄薄層色譜圖。

      重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn):取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對(duì)照品溶液,由兩名實(shí)驗(yàn)人員照A和B按照上述方法做薄層鑒別實(shí)驗(yàn),記錄薄層色譜圖。

      耐用性實(shí)驗(yàn):取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對(duì)照品溶液,按照上述方法但使用兩批不同批次的薄層色譜板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),記錄薄層色譜圖

      薄層鑒別項(xiàng)檢驗(yàn):分別吸供試品溶液、對(duì)照品3種溶液各10~20μL,依次點(diǎn)于同一薄層色譜板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),記錄薄層色譜圖。

      1.3.2 重金屬及有害元素檢查項(xiàng)的建立 對(duì)照品溶液的制備:取砷、鉛、汞、鎘、銅元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別于100 mL容量瓶中制得到各含元素1、1、0.1、0.1、100μg/mL的母液。測(cè)定砷含量時(shí)取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL,分別加入5 mL鹽酸、2%硫脲與1%抗壞血酸后加純水定容至100 mL;測(cè)定鉛含量時(shí)取母液0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL,分別加入1.5 mL鹽酸后加純水至100 mL;測(cè)定汞含量時(shí)取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL,分別加入5 mL鹽酸后加純水至100 mL;測(cè)定鎘、銅含量時(shí)取母液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,分別加入1.5 mL鹽酸后加純水定容至100 mL。即得各元素的對(duì)照品溶液。

      供試品溶液的制備:3批次裸花紫珠散劑各取1 g,分別加10 mL純水、1.5 mL高氯酸、15 mL硝酸后置于電熱板上消化。消化后測(cè)定砷含量時(shí)加2.5 mL鹽酸、2%硫脲和1%抗壞血酸后加純水定容至50 mL,測(cè)定鉛含量時(shí)加1.5 mL硝酸后加純水定容至50 mL,測(cè)定汞含量時(shí)加2.5 mL鹽酸后加純水定容至50 mL、測(cè)定鎘含量時(shí)加1.5 mL鹽酸后加純水定容至50 mL、測(cè)定銅含量時(shí)加1.5 mL鹽酸后純水定容至50 mL。即得各元素的供試品溶液。

      儀器參數(shù)設(shè)置:砷:原子熒光光譜儀,5%鹽酸載流,還原溶液為2%硼氫化鉀與0.4%KOH,負(fù)高壓290 V,燈電流75 mA;鉛:原子熒光光譜儀,1.5%硝酸與0.2%鐵氰化鉀載流,還原溶液為1%硼氫化鉀與0.2%KOH,負(fù)高壓270 V,燈電流65 mA;汞:原子熒光光譜儀,5%鹽酸載流,還原溶液為0.5%硼氫化鉀與0.1%KOH,負(fù)高壓270 V,燈電流75 mA;鎘:原子熒光光譜儀,5%鹽酸與2%硫脲載流,還原溶液為2%硼氫化鉀與0.4%KOH,負(fù)高壓270 V,燈電流60 mA;銅:原子吸收光譜儀,測(cè)定波長(zhǎng)為324.7,燈電流8 mA,火焰類型Air-C2H2。

      標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:配制5種重金屬元素不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)行檢測(cè),建立5種重金屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      精密度試驗(yàn):隨機(jī)抽取一瓶供試品溶液,重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算砷、鉛、汞、鎘、銅元素的平均值。

      回收率試驗(yàn):取已知重金屬及有害元素離子含量的樣品,分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的各元素對(duì)照品溶液,按上述方法測(cè)定砷、鉛、汞、鎘、銅元素加標(biāo)回收率。

      樣品中重金屬及有害元素含量測(cè)定:采用上述建立的方法,對(duì)3批裸花紫珠散劑樣品中5種重金屬及有害元素進(jìn)行檢測(cè)。

      1.3.3 高效液相色譜法含量測(cè)定方法的建立 色譜條件:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.1%甲酸溶液-乙腈(85∶15)為流動(dòng)相,選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè),木犀草苷檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm,毛蕊花糖苷檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm;柱溫為35℃;流速1.0 mL/min。

      供試品溶液的制備:取三批裸花紫珠散劑,各1 g,分別放入具塞錐形瓶中,加70%甲醇50 mL,超聲40 min。放冷,用甲醇補(bǔ)足。搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

      對(duì)照品溶液的制備:精密稱取木犀草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品,加70%甲醇配置成每1 mL含木犀草苷20 mg、毛蕊花糖苷250 mg的混合對(duì)照品溶液,即得。

      標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)(X),以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理,計(jì)算出木犀草苷和毛蕊花糖苷的線性回歸方程。

      含量測(cè)定:采用含量測(cè)定的方法,取3批裸花紫珠局部用散劑進(jìn)行含量測(cè)定。

      2 結(jié)果

      2.1 薄層色譜鑒別項(xiàng)建立結(jié)果

      2.1.1 專屬性、重現(xiàn)性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果 專屬性試驗(yàn)薄層色譜圖中對(duì)照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn),斑點(diǎn)清晰可見(jiàn),兩種成分分離度較好,見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照溶液無(wú)熒光斑點(diǎn),說(shuō)明該方法專屬性良好。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2,兩名實(shí)驗(yàn)員得到的薄層色譜圖基本一致,兩份色譜圖中對(duì)照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn),斑點(diǎn)清晰可見(jiàn),兩種成分分離度較好,說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3,不同批次薄層板得到的薄層色譜圖基本一致,對(duì)照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn),斑點(diǎn)清晰可見(jiàn),兩種成分分離度較好,說(shuō)明該方法耐用性良好。

      圖1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig 1 Specific r esults

      圖2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Reproducibility results

      圖3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Serviceability results

      2.1.2 薄層色譜鑒別項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果 3批裸花紫珠散劑供試液在薄層色譜圖上與木犀草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。該方法熒光斑點(diǎn)清晰可見(jiàn),兩種成分分離度較好,該薄層色譜鑒別項(xiàng)簡(jiǎn)單可行。見(jiàn)圖4。

      2.2 重金屬及有害元素檢查項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果

      圖4 裸花紫珠散劑薄層檢驗(yàn)結(jié)果Fig 4 TLC results of callicarpa nudiflora powder

      2.2.1 重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以元素濃度為橫坐標(biāo),吸光度或者熒光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到5種重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。由表可知,5種重金屬及有害元素的相關(guān)系數(shù)均在0.996以上,表明5種元素線性關(guān)系良好。

      表1 重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 Standard curve of heavy metals and harmful elements

      2.2.2 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)抽取一瓶供試品溶液,重復(fù)測(cè)定6次,砷、鉛、汞、鎘、銅元素平均值分別為2.918、10.015、0.631、0.297、0.044 7(μg/kg),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%,表明該方法精密度良好。見(jiàn)表2。

      表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(μg/kg)Tab 2 Precision results(μg/kg)

      砷、鉛、汞、鎘、銅元素加標(biāo)回收率平均值分別為96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%,表明該方法能準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)樣品中的5種重金屬含量及有害元素。見(jiàn)表3。

      表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery results

      2.2.3 重金屬及有害元素含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果 重金屬及有害元素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4,3批裸花紫珠散劑中示砷含量平均值為2.745μg/kg、鉛含量平均值為10.413μg/kg、汞含量平均值為0.860μg/kg、鎘含量平均值為0.252μg/kg、銅含量平均值為0.046 7 μg/kg。以上重金屬及有害元素含量遠(yuǎn)低于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的綠色藥材重金屬限量要求,表明本品重金屬及有害元素含量符合要求。

      表4 3批散劑的重金屬含量(μg/kg)Tab 4 Content of heavy metals in three batches of callicarpanudiflora powder(μg/kg)

      2.3 含量檢測(cè)項(xiàng)建立試驗(yàn)結(jié)果

      2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)(X),以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理,所得到的木犀草苷的線性回歸方 程 為:Y=53 342X-36 343,r=1.000 0;毛蕊花糖苷的線性回歸方程為:Y=379 198X-152 266,r=0.999 9。見(jiàn)圖5。

      圖5 木犀草苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curve

      2.3.2 含量測(cè)定結(jié)果 毛蕊花糖苷和木犀草苷的液相色譜圖可見(jiàn)圖6、7,檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm保留時(shí)間為23 min處的峰為毛蕊花糖苷,檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm保留時(shí)間21 min處峰為木犀草苷。對(duì)3批裸花紫珠散劑進(jìn)行木犀草苷和毛蕊花糖苷含量測(cè)定,木犀草苷和毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.614 7和7.282 2 mg/g,以平均含量的80%為下限,規(guī)定裸花紫珠散劑中木犀草苷含量應(yīng)不低于0.48%,毛蕊花糖苷含量應(yīng)不低于5.83%,見(jiàn)表5。

      圖6 毛蕊花糖苷的色譜圖Fig 6 HPLC of mullein glycoside

      圖7 木犀草苷的色譜圖Fig 7 HPLC of luteolin

      表5 裸花紫珠散劑含量測(cè)定結(jié)果Tab 5 Content determination results of callicarpa nudiflora powder

      3 討論

      本研究建立了裸花紫珠散劑的薄層色譜鑒定法,對(duì)此方法用于裸花紫珠散劑鑒定的專屬性、重復(fù)性、耐用性進(jìn)行了考察。該方法熒光斑點(diǎn)清晰可見(jiàn),兩種主要成分木犀草苷和毛蕊花糖苷成分分離度較好專屬性、重現(xiàn)性、耐用性效果良好,同時(shí)基于該薄層色譜法建立了裸花紫珠散劑的薄層鑒別項(xiàng)。

      利用火焰原子吸收法和氫化物原子熒光法,建立了裸花紫珠散劑鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬及有害元素的測(cè)定方法,砷、鉛、汞、鎘、銅5種重金屬元素的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 1、0.999 1、0.999 8,0.996 4、0.999 6,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%,回收率平均值分別為96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%,結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定。裸花紫珠散劑中砷含量平均值為2.745μg/kg、鉛含量平均值為10.413μg/kg、汞含量平均值為0.860μg/kg、鎘含量平均值為0.252μg/kg、銅含量平均值為0.046 7μg/kg。以上重金屬含量遠(yuǎn)低于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的綠色藥材重金屬限量要求。同時(shí),建立了裸花紫珠散劑鑒別的重金屬檢查項(xiàng):按照檢測(cè)鉛、鎘、砷、汞、銅含量方法測(cè)定,鉛不超過(guò)5 mg/kg,鎘不超過(guò)0.3 mg/kg,砷不超過(guò)2 mg/kg,汞不超過(guò)0.2 mg/kg,銅不超過(guò)20 mg/kg。

      采用高效液相色譜法測(cè)定裸花紫珠中主要有效成分木犀草苷和毛蕊花糖苷的含量,木犀草苷的線性回歸方程為:Y=53 342X-36 343,線性相關(guān)系數(shù)為1;毛蕊花糖苷的線性回歸方程為:Y=379 198X-152 266,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。含量測(cè)定結(jié)果,木犀草苷平均值為0.061 47 mg/g、毛蕊花糖苷平均值為7.282 2 mg/g。以平均含量的80%為下限,建立了裸花紫珠散劑含量測(cè)定項(xiàng),規(guī)定裸花紫珠散劑中木犀草苷含量應(yīng)不低于0.48%,毛蕊花糖苷含量應(yīng)不低于5.83%。

      綜上所述,本研究所建立的黎藥裸花紫珠散劑質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單,專屬性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性好,可用于裸花紫珠散劑的質(zhì)量控制。

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