紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡、生長和運動能力的影響

李力，郭祥翠，王倩青，李君，郜智慧

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其死亡率在所有婦科惡性腫瘤中最高。據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計，卵巢癌占所有女性惡性腫瘤的2.5%以上［1］。由于早期不易被發(fā)現(xiàn)，中期發(fā)展迅速，晚期難于治療，卵巢癌病死率逐年遞增。目前針對卵巢癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等，但治療效果均不理想且有不良反應(yīng)［2］。紅芪是豆科植物多序黃巖芪的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血、排膿托毒等功效，常用于氣虛乏力、血虛萎黃、表虛自汗等［3］。紅芪多糖是從紅芪中提取出的多糖成分，由葡萄糖、木糖、半乳糖等5種單糖構(gòu)成，因其生物活性豐富、藥效強(qiáng)等特點而被廣泛應(yīng)用。研究表明，紅芪多糖在多種癌癥和炎性疾病中發(fā)揮調(diào)控作用［4］。但是，紅芪多糖在卵巢癌中的研究鮮見報道。本研究旨在探索紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡、生長和運動的調(diào)控作用，為紅芪多糖在卵巢癌中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 紅芪多糖（純度≥90%）購自四川維克奇生物公司（貨號：wkq-10046），人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司（貨號：16141-079），CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司（貨號：C0037），RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司（貨號：KK5023），Transwell小室和結(jié)晶紫染料購自日本TaKaRa公司，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）和纖維粘連蛋白（FN）兔單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的對應(yīng)二抗均購自英國Abcam公司，ABI7500 Real-Time PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）；酶標(biāo)儀（Rayto，RT6100），臺式高速離心機(jī)（大龍，D3024R），成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R），光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 將卵巢癌SKOV3細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用，參照文獻(xiàn)［5］用0、3、6、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 mg/L紅芪多糖培養(yǎng)處理細(xì)胞24 h。

1.2.2 CCK-8篩選藥物劑量 按照CCK-8試劑盒說明書操作，從0、3、6、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 mg/L中篩選紅芪多糖劑量，在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔），將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2），向每孔加入10μL CCK溶液，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度（OD）。細(xì)胞活力=（對照孔OD值－實驗孔OD值）/（對照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

1.2.3 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和白細(xì)胞介素（IL）-6的mRNA表達(dá)水平 選擇對數(shù)生長期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，細(xì)胞經(jīng)不同劑量紅芪多糖處理24 h后，用胰酶消化并收集細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA并測定其濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：20℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，40℃逆轉(zhuǎn)錄45 min，90℃滅活2 min。按PCR試劑盒說明書上機(jī)實驗，PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，60℃30 s，共循環(huán)40次。熔解曲線：從60℃開始，每15 s上升0.3℃，直到95℃，循環(huán)1次，以β-actin作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。獨立重復(fù)實驗3次，取平均值。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：TNF-α上游5'-AGGCGCTCCCCAAAAAGATG-3'，下游5'-TGGCGGAGAGGAGGCTGACT-3'；iNOS上 游 5'-CCAAGAACGTGTTCACCATG-3'，下 游5'-GATGTCCAG?GAAGTAGGTGAGG-3'；IL-6上 游5'-GAGGAGACTTCA?CAGAGGATAC-3'，下游5'-GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG-3'；β-actin上 游5'-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3'，下 游5'-CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT-3'。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集卵巢癌SKOV3細(xì)胞對數(shù)生長期貼壁細(xì)胞，用不同劑量紅芪多糖處理24 h后，預(yù)冷PBS緩沖液漂洗2~3次，流式細(xì)胞分選技術(shù)將緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個，加入單克隆抗體并充分混勻，室溫避光孵育15 min后，采用BD FACS Aria流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，獨立重復(fù)實驗3次。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細(xì)胞生長 選擇0、50、100、200 mg/L紅芪多糖給藥培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度達(dá)75%~85%且生長狀態(tài)良好時，用胰蛋白酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)并取細(xì)胞懸液于6孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)在500~1 000之間，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d換液1次，至肉眼可見壁底部形成大小白色斑點時終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色10~30 min，計算克隆形成率（克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）。

1.2.6 Transwell檢測細(xì)胞侵襲 Matrigel膠融化后均勻鋪于Transwell小室底層上室中，SKOV3細(xì)胞用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使其處于饑餓狀態(tài)，經(jīng)胰蛋白酶消化后用DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以每孔1×105個細(xì)胞加入Transwell小室上室中，下室加入DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按1.2.1方法給藥培養(yǎng)處理24 h，取出小室，經(jīng)多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下選取5個不同視野觀察并計數(shù)（侵襲細(xì)胞被染成紫色）。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 Western blot檢測 選擇對數(shù)生長期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，各組用紅芪多糖處理24 h后，胰酶消化細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細(xì)胞蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入VEGF（1∶200）、E-cadherin（1∶200）和FN一抗（1∶500），4℃孵育搖床過夜?；厥找豢?，加入按比例稀釋HRP標(biāo)記的對應(yīng)二抗（1∶4 000），室溫孵育120 min。ECL發(fā)光，暗室下曝光顯影（ACTIN作內(nèi)參）。將膠片進(jìn)行掃描存檔，photoshop整理去色，Alpha軟件分析OD值。獨立實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件分析。正態(tài)分布的計量資料以x±s表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響 不同濃度紅芪多糖處理卵巢癌SKOV3細(xì)胞24 h后，CCK8檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，0、3、6、12.5、25、50、100、200、400、800和1600 mg/L紅芪多糖處理后，細(xì)胞活力分別為（100±4）%、（100±6）%、（99±5）%、（96±7）%、（90±6）%、（83±8）%、（58±7）%、（34±6）%、（17±5）%、（9±4）%和（4±3）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=142.880，P＜0.05）。本實驗選擇0、50、100和200 mg/L紅芪多糖進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 紅芪多糖對SKOV3細(xì)胞TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表達(dá)水平的影響 與0 mg/L紅芪多糖組相比，50 mg/L紅芪多糖組TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表達(dá)水平均無明顯差異，100 mg/L和200 mg/L紅芪多糖組TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），見表1。

Tab.1 The effect of radix hedysari polysaccharide on mRNA levels of TNF-α,iNOS and IL-6 in ovarian cancer SKOV3 cells表1紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響 （n=3，±s）

Tab.1 The effect of radix hedysari polysaccharide on mRNA levels of TNF-α,iNOS and IL-6 in ovarian cancer SKOV3 cells表1紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與0 mg/L紅芪多糖組比較，P＜0.05

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2.3 紅芪多糖對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響 0、50、100和200 mg/L紅芪多糖組細(xì)胞凋亡率分別為（1.51±0.40）%、（1.69±0.50）%、（7.88±1.20）%、（15.62±2.40）%，4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=28.103，P＜0.05）。與0 mg/L紅芪多糖組相比，50 mg/L紅芪多糖組細(xì)胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05），100 mg/L和200 mg/L紅芪多糖組細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），見圖1。

2.4 紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞克隆形成率的影響 0 mg/L紅芪多糖組卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長

Fig.1 Flow cytometric detection of apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡率

旺盛，形成的集落形成數(shù)較多，50 mg/L紅芪多糖組集落形成數(shù)略有減少，100和200 mg/L紅芪多糖組細(xì)胞生長明顯被抑制，集落形成數(shù)極少。各組細(xì)胞克隆形成率分別為（40±8）%、（38±6）%、（15±7）%、（6±4）%。與0 mg/L紅芪多糖組相比，50 mg/L紅芪多糖組卵巢癌SKOV3細(xì)胞克隆形成率無明顯差異，100和200 mg/L紅芪多糖組卵巢癌SKOV3細(xì)胞克隆形成率顯著降低（n=3，F(xiàn)=12.308，P＜0.05），見圖2。

2.5 紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響 0、50、100、200 mg/L紅芪多糖組侵襲細(xì)胞數(shù)分別 為45.25±7.31、43.12±6.30、25.04±8.11、10.23±4.51個/視野。與0 mg/L紅芪多糖組相比，50 mg/L紅芪多糖組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，100 mg/L和200 mg/L紅芪多糖組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少（n=3，F(xiàn)=36.324，P＜0.05），見圖3。

Fig.2 The growth of ovarian cancer SKOV3 cells detected by clone formation test圖2 克隆形成實驗檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長

Fig.3 The ovarian cancer SKOV3 cells invasion detected by Transwell assay(×400)圖3 Transwell檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲（×400）

2.6 紅芪多糖對SKOV3細(xì)胞VEGF、E-cadherin和FN蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示，與0 mg/L紅芪多糖組相比，50 mg/L紅芪多糖組VEGF、E-cadherin、FN蛋白表達(dá)水平無明顯差異，100和200 mg/L紅芪多糖組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，VEGF和FN蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖4、表2。

Fig.4 Western blot detection of VEGF,E-cadherin and FN protein expression levels in ovarian cancer SKOV3 cells圖4 Western blot檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞VEGF、E-cadherin和FN表達(dá)水平

Tab.2 The effect of radix hedysari polysaccharide on VEGF,E-cadherin and FN protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells表2紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中VEGF、E-cadherin、FN蛋白表達(dá)水平的影響 （n=3，±s）

Tab.2 The effect of radix hedysari polysaccharide on VEGF,E-cadherin and FN protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells表2紅芪多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中VEGF、E-cadherin、FN蛋白表達(dá)水平的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與0 mg/L紅芪多糖組相比，P＜0.05

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3 討論

紅芪多糖是紅芪的主要活性成分，它具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理作用，如紅芪多糖聯(lián)合甘露糖能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和運動能力，紅芪多糖可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡及Bax/Bcl-2表達(dá)等［6-7］。本研究結(jié)果顯示，紅芪多糖能抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力，且紅芪多糖劑量越高抑制作用越明顯，提示紅芪多糖在卵巢癌細(xì)胞發(fā)生中具有調(diào)控作用。

炎性細(xì)胞因子是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在炎癥發(fā)生過程中，炎性細(xì)胞因子激活并誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞釋放有害物質(zhì)，促使細(xì)胞壞死或凋亡［8］。TNF-α在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)且能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡［9］。iNOS是一種同工酶，常作為機(jī)體內(nèi)炎癥程度指標(biāo)，主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中。Kielbik等［10］指出，iNOS在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與卵巢癌耐藥性密切相關(guān)。也有研究報道，iNOS通過干擾糖酵解過程，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和抗氧化能力［11］。IL-6是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖并促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展［12］。以上研究表明，炎性細(xì)胞因子TNF-α、iNOS和IL-6高表達(dá)能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力，抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紅芪多糖處理后，卵巢癌細(xì)胞中TNF-α、iNOS和IL-6mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，紅芪多糖能通過下調(diào)TNF-α、iNOS和IL-6表達(dá)水平，抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)凋亡。

癌細(xì)胞生長和侵襲是卵巢癌細(xì)胞擴(kuò)散的前提，癌細(xì)胞生長依賴于腫瘤細(xì)胞分化和成熟程度，分化程度越低、成熟度越低的腫瘤細(xì)胞惡化的可能性越大。腫瘤細(xì)胞侵襲是指細(xì)胞通過分泌酶類物質(zhì)，裂解周圍細(xì)胞基底膜，從而擴(kuò)散至其他細(xì)胞或組織的過程［13］。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，VEGF可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡［14-15］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)紅芪多糖處理后，卵巢癌細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)量明顯減少，細(xì)胞生長和侵襲能力顯著被抑制，提示紅芪多糖可通過抑制VEGF蛋白表達(dá)降低卵巢癌細(xì)胞生長和侵襲能力。

間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密，具有極強(qiáng)的黏附性和細(xì)胞極性。而間質(zhì)細(xì)胞則與之相反，細(xì)胞之間結(jié)構(gòu)松散，黏附能力極弱，且不具有細(xì)胞極性，因此間質(zhì)細(xì)胞具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力［16］。E-cadherin是間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中重要的抑制蛋白，E-cadherin能夠增強(qiáng)細(xì)胞之間的緊密連接和細(xì)胞極性。研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在卵巢癌細(xì)胞中異常表達(dá)與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［17-18］。FN是一種高分子糖蛋白，它能夠降低細(xì)胞之間的黏附性，提高腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力［19-20］。本實驗中，紅芪多糖上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)FN蛋白表達(dá)，提示紅芪多糖可通過調(diào)控E-cadherin和FN蛋白表達(dá)抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞運動能力。

綜上所述，紅芪多糖能促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長、侵襲和間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，但其具體的作用機(jī)制有待更進(jìn)一步的研究。